本文關(guān)鍵詞：顱腦創(chuàng)傷中炎性體蛋白的表達(dá)及預(yù)后評(píng)估作用的研究

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【摘要】：背景：顱腦創(chuàng)傷是一種高死亡率和高致殘率的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,特別是年輕人致死致殘的最主要原因。隨著醫(yī)療救治水平的提高,顱腦創(chuàng)傷的死亡率有所下降,但致殘率仍據(jù)高不下,發(fā)病率也一直在上升,而且主要發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家,使得顱腦創(chuàng)傷成為全球性的公共衛(wèi)生和社會(huì)經(jīng)濟(jì)難題。顱腦創(chuàng)傷病情的早期診斷和預(yù)后的準(zhǔn)確評(píng)估意義重大,它決定了臨床治療方案的選擇,并影響患者最終預(yù)后。但傳統(tǒng)的評(píng)估方法(如格拉斯哥昏迷評(píng)分[Glasgow Coma Scale,GCS]和CT檢查等)特異性和敏感性不高,且?guī)в兄饔^色彩,已不能滿(mǎn)足現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的需求。近年來(lái),磁共振彌散張量成像、磁共振波譜和功能磁共振等神經(jīng)影像技術(shù),腦電圖、體感誘發(fā)電位和事件相關(guān)電位等神經(jīng)電生理技術(shù),以及生化標(biāo)志物技術(shù)發(fā)展迅速,為顱腦創(chuàng)傷的病情診斷和預(yù)后評(píng)估提供了更為客觀和準(zhǔn)確的方法。在眾多評(píng)估方法中篩選出準(zhǔn)確性高、實(shí)用性強(qiáng)的指標(biāo),并建立一套顱腦創(chuàng)傷預(yù)后的綜合評(píng)估體系是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究重點(diǎn)和社會(huì)責(zé)任。炎性體是固有免疫領(lǐng)域近十年來(lái)的重大發(fā)現(xiàn),它是一類(lèi)細(xì)胞內(nèi)的多蛋白復(fù)合體,一般由NOD樣受體家族的部分成員(如NOD樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白1[NLR family, pyrin domain containing1,NLRP1]、NLRP3等)和半胱天冬酶-1(caspase-1)以及輔助蛋白接頭分子凋亡相關(guān)點(diǎn)樣蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)組成。NOD樣受體識(shí)別外源性病原微生物的病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular pattern, PAMP)或者內(nèi)源性損傷分子的損傷相關(guān)分子模式(Damage-associated molecular pattern, DAMP)后可組裝成炎性體,并激活caspase-1,進(jìn)而導(dǎo)致白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-1β等促炎因子的成熟和分泌而引起固有免疫炎癥反應(yīng),以及一種稱(chēng)為"pyrotosis"的細(xì)胞死亡的發(fā)生。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,小膠質(zhì)細(xì)胞、星形細(xì)胞和神經(jīng)元均存在炎性體,能在感染或損傷的局部神經(jīng)組織引起炎癥反應(yīng),如膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、外周血白細(xì)胞的滲入,并造成繼發(fā)性腦損傷。IL-1β是炎性體信號(hào)通路的主要產(chǎn)物,也是一種比較明確的神經(jīng)炎癥指標(biāo)和腦損傷標(biāo)志物,研究發(fā)現(xiàn)顱腦創(chuàng)傷患者外周血或腦脊液中IL-1β水平升高,且與臨床病情和預(yù)后相關(guān)。炎性體是IL-1β的上游調(diào)節(jié)蛋白,在IL-1β的產(chǎn)生和神經(jīng)炎癥的啟動(dòng)中起重要作用,并與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān),也有研究發(fā)(?)NLRP1和NLRP3炎性體參與顱腦創(chuàng)傷病理生理過(guò)程,但其在顱腦創(chuàng)傷中的表達(dá)及作用仍不明確。因此,本研究的目的是：一、通過(guò)建立小鼠顱腦創(chuàng)傷模型以觀察炎性體蛋白NLRP1和NLRP3在顱腦創(chuàng)傷中的表達(dá)情況；二、通過(guò)測(cè)定顱腦創(chuàng)傷患者腦脊液中NLRP1和NLRP3水平,以探討炎性體蛋白對(duì)顱腦創(chuàng)傷臨床病情和功能預(yù)后的評(píng)估作用。 方法：1、炎性體蛋白NLRP1和NLRP3在小鼠顱腦創(chuàng)傷模型中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究：1.1、小鼠顱腦創(chuàng)傷模型的建立：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用C57BL/6小鼠(SPF級(jí),雄性,10～12周齡,體重28～40g),小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=5)、假手術(shù)組(n=5)和4個(gè)創(chuàng)傷組(n=8)。參考Shohami的小鼠自由落體打擊模型自制重物打擊裝置,使333g重物從2.5cm高度自由落體打擊鼠腦,以建立小鼠顱腦創(chuàng)傷模型。小鼠致傷后1h行神經(jīng)損傷度評(píng)分(neurological severity score,NSS),取NSS7～8分者為重度腦損傷小鼠繼續(xù)實(shí)驗(yàn),分別于傷后6h、1d、3d和7d斷頭處死,取挫傷周?chē)X組織檢測(cè)。1.2、Western blot法測(cè)定小鼠腦組織炎性體蛋白的表達(dá)：由小鼠挫傷周?chē)X組織提取總蛋白,考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白濃度,根據(jù)蛋白濃度加樣行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后予相應(yīng)特異性抗體免疫目的蛋白,以β-Actin為內(nèi)參考,用化學(xué)發(fā)光法和AlphaEase FC軟件檢測(cè)樣品中炎性體蛋白的相對(duì)含量。1.3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,組間比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用LSD法。 2、炎性體蛋白NLRP1和NLRP3對(duì)顱腦創(chuàng)傷患者預(yù)后評(píng)估作用的臨床研究：2.1、顱腦創(chuàng)傷患者的納入和管理：納入2013年5月至7月于我科住院治療的重型顱腦損傷患者20例,納入標(biāo)準(zhǔn)為：傷后72h內(nèi)入院、GCS評(píng)分≤8分和年齡12歲。排除標(biāo)準(zhǔn)為：合并嚴(yán)重顱外臟器損傷、明顯中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、無(wú)法簽署知情同意書(shū)和無(wú)法獲取腦脊液標(biāo)本。對(duì)照者為我科住院治療的排除顱內(nèi)感染的中型顱腦損傷患者(8GCS13)7例和非顱腦創(chuàng)傷患者8例。所有顱腦創(chuàng)傷患者入院后均行頭部CT檢查,CT結(jié)果按Marshall標(biāo)準(zhǔn)分6級(jí)。患者預(yù)后以傷后6個(gè)月的格拉斯哥預(yù)后評(píng)分(Glasgow Outcome Scale, GOS)評(píng)估,其中1～3分記為預(yù)后不良,4-5分記為預(yù)后良好。記錄患者年齡、GCS評(píng)分、瞳孔反射、CT分級(jí)、GOS評(píng)分等臨床資料。2.2、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定顱腦創(chuàng)傷患者腦脊液中炎性體蛋白的濃度：重型顱腦損傷患者腦脊液標(biāo)本由側(cè)腦室引流管或腰椎穿刺獲取,于傷后24h和72h各取一次腦脊液,并以平均濃度計(jì)入統(tǒng)計(jì),對(duì)照者腦脊液標(biāo)本由腰椎穿刺獲取一次。腦脊液炎性體蛋白濃度以ELISA法、購(gòu)買(mǎi)試劑盒檢測(cè),操作過(guò)程嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,予酶標(biāo)儀讀取標(biāo)準(zhǔn)物光度值并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)將樣品炎性體蛋白光度值換算為定量濃度。2.3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,組間均數(shù)比較采用隨機(jī)設(shè)計(jì)資料秩和檢驗(yàn)(兩組比較,Mann-Whitney檢驗(yàn)；多組比較,Kruskal-Wallis檢驗(yàn)；組間多重比較,LSD檢測(cè))。顱腦創(chuàng)傷患者NLRP3濃度與年齡、GCS評(píng)分和CT表現(xiàn)行Spearman等級(jí)相關(guān)分析,與GOS評(píng)分行線(xiàn)性回歸分析。 結(jié)果：1、炎性體蛋白NLRP1和NLRP3在小鼠顱腦創(chuàng)傷模型中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究：1.1、小鼠顱腦創(chuàng)傷模型的建立：333g重物和2.5cm高度自由落體打擊鼠腦后32只小鼠中大部分(24只)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)、平衡和反應(yīng)等神經(jīng)功能的明顯障礙,平均NSS為(7.5±0.3)分,鼠腦大體標(biāo)本亦可見(jiàn)皮層挫傷表現(xiàn)。另有3只小鼠NSS小于7分,5只小鼠于傷后1h內(nèi)死亡,死亡率為15.6%,總體造模成功率為75%。1.2、小鼠腦組織炎性體蛋白的表達(dá)：Western blot結(jié)果顯示小鼠腦組織中表達(dá)炎性體蛋白NLRP1和NLRP3,其中NLRP3水平在腦損傷后明顯升高(P0.05),且于傷后6h達(dá)到高峰然后逐漸下降,但至第7天時(shí)仍處明顯的高水平。而創(chuàng)傷組各時(shí)間點(diǎn)的NLRP1水平與對(duì)照組比較并未見(jiàn)明顯變化。 2、炎性體蛋白NLRP1和NLRP3對(duì)顱腦創(chuàng)傷患者預(yù)后評(píng)估作用的臨床研究：2.1、顱腦創(chuàng)傷患者腦脊液中炎性體蛋白的表達(dá)：重型顱腦損傷患者傷后腦脊液中NLRP3平均濃度為(33.8士11.6)ng/ml,明顯高于中型顱腦損傷組([11.4±2.9]ng/ml,Z=-3.873,P0.001)和正常對(duì)照組([1.1士0.3]ng/ml,Z=-4.068,P0.001)。重型顱腦損傷患者傷后腦脊液中NLRP1平均濃度為(25.23±5.8)pg/ml,與對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。重型顱腦損傷患者中雙側(cè)瞳孔散大、側(cè)瞳孔散大及正常瞳孔三組間NLRP3濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=7.484,P=0.024),組間多重比較LSD檢驗(yàn)顯示前兩者與正常瞳孔組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而瞳孔散大組(一側(cè)和雙側(cè))間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明瞳孔散大組NLRPP3濃度明顯高于正常瞳孔組(P=0.024),其中瞳孔散大組腦脊液NLRP3平均濃度為(42.3士4.6)ng/ml,而瞳孔正常組腦脊液NLRP3平均濃度為(31.1士12.8)ng/ML。Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示重型顱腦損傷患者NLRP3的腦脊液濃度與CT表現(xiàn)(r=0.601,P=0.005)明顯相關(guān),與年齡、GCS評(píng)分無(wú)明顯相關(guān)。2.2、顱腦創(chuàng)傷患者腦脊液NLRP3濃度與臨床預(yù)后的相關(guān)性：重型顱腦損傷預(yù)后不良組的NLRP3腦脊液濃度為(42.8±14.4)ng/ml,明顯高于預(yù)后良好組([29.9±7.9]ng/ml,Z=-1.98,P=0.048),線(xiàn)性回歸分析顯示NLRP3濃度與患者傷后6個(gè)月的GOS評(píng)分明顯相關(guān)(r=0.665,P=0.001)。 結(jié)論：1、333g重物和2.5cm高度自由落體打擊鼠腦可建立可靠的小鼠顱腦創(chuàng)傷模型,小鼠腦組織中存在炎性體蛋白NLRP1和NLRP3,而且腦損傷能上調(diào)NLRP3的表達(dá),提示NLRP3炎性體參與腦損傷后炎癥反應(yīng),尤其是神經(jīng)炎癥的早期階段。2、顱腦創(chuàng)傷患者腦脊液中炎性體蛋白NLRP1濃度低,與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化,提示其作為腦損傷標(biāo)志物的敏感性差。而NLRP3水平反映腦損傷程度,可作為評(píng)估顱腦創(chuàng)傷臨床病情和功能預(yù)后的標(biāo)志物。
【關(guān)鍵詞】：炎性體 NOD樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白1 NOD樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3 顱腦創(chuàng)傷 預(yù)后
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R651.15
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-19
• 第一部分 炎性體蛋白NLRP1和NLRP3在小鼠顱腦創(chuàng)傷模型中的表達(dá)19-30
• 1 材料19-20
• 2 方法20-24
• 3 結(jié)果24-25
• 4 討論25-29
• 5 結(jié)論29-30
• 第二部分 炎性體蛋白NLRP1和NLRP3對(duì)顱腦創(chuàng)傷患者的預(yù)后評(píng)估作用30-46
• 1 材料30-31
• 2 方法31-34
• 3 結(jié)果34-37
• 4 討論37-45
• 5 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-52
• 綜述52-62
• 摘要52
• 1 中樞神經(jīng)系統(tǒng)中炎性體的表達(dá)52-56
• 2 顱腦創(chuàng)傷中炎性體的作用56-57
• 3 展望57-58
• 參考文獻(xiàn)58-62
• 英文縮寫(xiě)詞表62-64
• 攻讀學(xué)位期間成果64-65
• 致謝65-66

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 丁永忠;孫群周;張建生;;急性顱腦損傷后血清TNF-α,IL-1,IL-6,IL-8含量變化及其臨床意義[J];中國(guó)臨床神經(jīng)外科雜志;2006年01期

2 鐘春燕;胡志堅(jiān);;炎性體的研究進(jìn)展[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2012年03期

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本文編號(hào)：731408