本文關鍵詞：顱腦創(chuàng)傷中炎性體蛋白的表達及預后評估作用的研究

  更多相關文章： 炎性體 NOD樣受體家族含pyrin結構域蛋白1 NOD樣受體家族含pyrin結構域蛋白3 顱腦創(chuàng)傷 預后

【摘要】：背景：顱腦創(chuàng)傷是一種高死亡率和高致殘率的神經系統(tǒng)疾病,特別是年輕人致死致殘的最主要原因。隨著醫(yī)療救治水平的提高,顱腦創(chuàng)傷的死亡率有所下降,但致殘率仍據高不下,發(fā)病率也一直在上升,而且主要發(fā)生在發(fā)展中國家,使得顱腦創(chuàng)傷成為全球性的公共衛(wèi)生和社會經濟難題。顱腦創(chuàng)傷病情的早期診斷和預后的準確評估意義重大,它決定了臨床治療方案的選擇,并影響患者最終預后。但傳統(tǒng)的評估方法(如格拉斯哥昏迷評分[Glasgow Coma Scale,GCS]和CT檢查等)特異性和敏感性不高,且?guī)в兄饔^色彩,已不能滿足現代醫(yī)學的需求。近年來,磁共振彌散張量成像、磁共振波譜和功能磁共振等神經影像技術,腦電圖、體感誘發(fā)電位和事件相關電位等神經電生理技術,以及生化標志物技術發(fā)展迅速,為顱腦創(chuàng)傷的病情診斷和預后評估提供了更為客觀和準確的方法。在眾多評估方法中篩選出準確性高、實用性強的指標,并建立一套顱腦創(chuàng)傷預后的綜合評估體系是現代醫(yī)學的研究重點和社會責任。炎性體是固有免疫領域近十年來的重大發(fā)現,它是一類細胞內的多蛋白復合體,一般由NOD樣受體家族的部分成員(如NOD樣受體家族含pyrin結構域蛋白1[NLR family, pyrin domain containing1,NLRP1]、NLRP3等)和半胱天冬酶-1(caspase-1)以及輔助蛋白接頭分子凋亡相關點樣蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)組成。NOD樣受體識別外源性病原微生物的病原相關分子模式(Pathogen-associated molecular pattern, PAMP)或者內源性損傷分子的損傷相關分子模式(Damage-associated molecular pattern, DAMP)后可組裝成炎性體,并激活caspase-1,進而導致白細胞介素(interleukin, IL)-1β等促炎因子的成熟和分泌而引起固有免疫炎癥反應,以及一種稱為"pyrotosis"的細胞死亡的發(fā)生。中樞神經系統(tǒng)中,小膠質細胞、星形細胞和神經元均存在炎性體,能在感染或損傷的局部神經組織引起炎癥反應,如膠質細胞的增殖、外周血白細胞的滲入,并造成繼發(fā)性腦損傷。IL-1β是炎性體信號通路的主要產物,也是一種比較明確的神經炎癥指標和腦損傷標志物,研究發(fā)現顱腦創(chuàng)傷患者外周血或腦脊液中IL-1β水平升高,且與臨床病情和預后相關。炎性體是IL-1β的上游調節(jié)蛋白,在IL-1β的產生和神經炎癥的啟動中起重要作用,并與多種神經系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制有關,也有研究發(fā)(?)NLRP1和NLRP3炎性體參與顱腦創(chuàng)傷病理生理過程,但其在顱腦創(chuàng)傷中的表達及作用仍不明確。因此,本研究的目的是：一、通過建立小鼠顱腦創(chuàng)傷模型以觀察炎性體蛋白NLRP1和NLRP3在顱腦創(chuàng)傷中的表達情況；二、通過測定顱腦創(chuàng)傷患者腦脊液中NLRP1和NLRP3水平,以探討炎性體蛋白對顱腦創(chuàng)傷臨床病情和功能預后的評估作用。 方法：1、炎性體蛋白NLRP1和NLRP3在小鼠顱腦創(chuàng)傷模型中表達的實驗研究：1.1、小鼠顱腦創(chuàng)傷模型的建立：實驗動物選用C57BL/6小鼠(SPF級,雄性,10～12周齡,體重28～40g),小鼠隨機分為正常對照組(n=5)、假手術組(n=5)和4個創(chuàng)傷組(n=8)。參考Shohami的小鼠自由落體打擊模型自制重物打擊裝置,使333g重物從2.5cm高度自由落體打擊鼠腦,以建立小鼠顱腦創(chuàng)傷模型。小鼠致傷后1h行神經損傷度評分(neurological severity score,NSS),取NSS7～8分者為重度腦損傷小鼠繼續(xù)實驗,分別于傷后6h、1d、3d和7d斷頭處死,取挫傷周圍腦組織檢測。1.2、Western blot法測定小鼠腦組織炎性體蛋白的表達：由小鼠挫傷周圍腦組織提取總蛋白,考馬斯亮藍法檢測蛋白濃度,根據蛋白濃度加樣行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后予相應特異性抗體免疫目的蛋白,以β-Actin為內參考,用化學發(fā)光法和AlphaEase FC軟件檢測樣品中炎性體蛋白的相對含量。1.3、統(tǒng)計學方法：應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析,組間比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用LSD法。 2、炎性體蛋白NLRP1和NLRP3對顱腦創(chuàng)傷患者預后評估作用的臨床研究：2.1、顱腦創(chuàng)傷患者的納入和管理：納入2013年5月至7月于我科住院治療的重型顱腦損傷患者20例,納入標準為：傷后72h內入院、GCS評分≤8分和年齡12歲。排除標準為：合并嚴重顱外臟器損傷、明顯中樞神經系統(tǒng)感染、無法簽署知情同意書和無法獲取腦脊液標本。對照者為我科住院治療的排除顱內感染的中型顱腦損傷患者(8GCS13)7例和非顱腦創(chuàng)傷患者8例。所有顱腦創(chuàng)傷患者入院后均行頭部CT檢查,CT結果按Marshall標準分6級�；颊哳A后以傷后6個月的格拉斯哥預后評分(Glasgow Outcome Scale, GOS)評估,其中1～3分記為預后不良,4-5分記為預后良好。記錄患者年齡、GCS評分、瞳孔反射、CT分級、GOS評分等臨床資料。2.2、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定顱腦創(chuàng)傷患者腦脊液中炎性體蛋白的濃度：重型顱腦損傷患者腦脊液標本由側腦室引流管或腰椎穿刺獲取,于傷后24h和72h各取一次腦脊液,并以平均濃度計入統(tǒng)計,對照者腦脊液標本由腰椎穿刺獲取一次。腦脊液炎性體蛋白濃度以ELISA法、購買試劑盒檢測,操作過程嚴格按照產品說明書進行,予酶標儀讀取標準物光度值并制作標準曲線,根據標準曲線將樣品炎性體蛋白光度值換算為定量濃度。2.3、統(tǒng)計學方法：應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析,組間均數比較采用隨機設計資料秩和檢驗(兩組比較,Mann-Whitney檢驗；多組比較,Kruskal-Wallis檢驗；組間多重比較,LSD檢測)。顱腦創(chuàng)傷患者NLRP3濃度與年齡、GCS評分和CT表現行Spearman等級相關分析,與GOS評分行線性回歸分析。 結果：1、炎性體蛋白NLRP1和NLRP3在小鼠顱腦創(chuàng)傷模型中表達的實驗研究：1.1、小鼠顱腦創(chuàng)傷模型的建立：333g重物和2.5cm高度自由落體打擊鼠腦后32只小鼠中大部分(24只)出現運動、平衡和反應等神經功能的明顯障礙,平均NSS為(7.5±0.3)分,鼠腦大體標本亦可見皮層挫傷表現。另有3只小鼠NSS小于7分,5只小鼠于傷后1h內死亡,死亡率為15.6%,總體造模成功率為75%。1.2、小鼠腦組織炎性體蛋白的表達：Western blot結果顯示小鼠腦組織中表達炎性體蛋白NLRP1和NLRP3,其中NLRP3水平在腦損傷后明顯升高(P0.05),且于傷后6h達到高峰然后逐漸下降,但至第7天時仍處明顯的高水平。而創(chuàng)傷組各時間點的NLRP1水平與對照組比較并未見明顯變化。 2、炎性體蛋白NLRP1和NLRP3對顱腦創(chuàng)傷患者預后評估作用的臨床研究：2.1、顱腦創(chuàng)傷患者腦脊液中炎性體蛋白的表達：重型顱腦損傷患者傷后腦脊液中NLRP3平均濃度為(33.8士11.6)ng/ml,明顯高于中型顱腦損傷組([11.4±2.9]ng/ml,Z=-3.873,P0.001)和正常對照組([1.1士0.3]ng/ml,Z=-4.068,P0.001)。重型顱腦損傷患者傷后腦脊液中NLRP1平均濃度為(25.23±5.8)pg/ml,與對照組間差異無統(tǒng)計學意義。重型顱腦損傷患者中雙側瞳孔散大、側瞳孔散大及正常瞳孔三組間NLRP3濃度差異有統(tǒng)計學意義(x2=7.484,P=0.024),組間多重比較LSD檢驗顯示前兩者與正常瞳孔組間差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05),而瞳孔散大組(一側和雙側)間差異無統(tǒng)計學意義,說明瞳孔散大組NLRPP3濃度明顯高于正常瞳孔組(P=0.024),其中瞳孔散大組腦脊液NLRP3平均濃度為(42.3士4.6)ng/ml,而瞳孔正常組腦脊液NLRP3平均濃度為(31.1士12.8)ng/ML。Spearman等級相關分析顯示重型顱腦損傷患者NLRP3的腦脊液濃度與CT表現(r=0.601,P=0.005)明顯相關,與年齡、GCS評分無明顯相關。2.2、顱腦創(chuàng)傷患者腦脊液NLRP3濃度與臨床預后的相關性：重型顱腦損傷預后不良組的NLRP3腦脊液濃度為(42.8±14.4)ng/ml,明顯高于預后良好組([29.9±7.9]ng/ml,Z=-1.98,P=0.048),線性回歸分析顯示NLRP3濃度與患者傷后6個月的GOS評分明顯相關(r=0.665,P=0.001)。 結論：1、333g重物和2.5cm高度自由落體打擊鼠腦可建立可靠的小鼠顱腦創(chuàng)傷模型,小鼠腦組織中存在炎性體蛋白NLRP1和NLRP3,而且腦損傷能上調NLRP3的表達,提示NLRP3炎性體參與腦損傷后炎癥反應,尤其是神經炎癥的早期階段。2、顱腦創(chuàng)傷患者腦脊液中炎性體蛋白NLRP1濃度低,與對照組比較無明顯變化,提示其作為腦損傷標志物的敏感性差。而NLRP3水平反映腦損傷程度,可作為評估顱腦創(chuàng)傷臨床病情和功能預后的標志物。
【關鍵詞】：炎性體 NOD樣受體家族含pyrin結構域蛋白1 NOD樣受體家族含pyrin結構域蛋白3 顱腦創(chuàng)傷 預后
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R651.15
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-19
• 第一部分 炎性體蛋白NLRP1和NLRP3在小鼠顱腦創(chuàng)傷模型中的表達19-30
• 1 材料19-20
• 2 方法20-24
• 3 結果24-25
• 4 討論25-29
• 5 結論29-30
• 第二部分 炎性體蛋白NLRP1和NLRP3對顱腦創(chuàng)傷患者的預后評估作用30-46
• 1 材料30-31
• 2 方法31-34
• 3 結果34-37
• 4 討論37-45
• 5 結論45-46
• 參考文獻46-52
• 綜述52-62
• 摘要52
• 1 中樞神經系統(tǒng)中炎性體的表達52-56
• 2 顱腦創(chuàng)傷中炎性體的作用56-57
• 3 展望57-58
• 參考文獻58-62
• 英文縮寫詞表62-64
• 攻讀學位期間成果64-65
• 致謝65-66

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前2條

1 丁永忠;孫群周;張建生;;急性顱腦損傷后血清TNF-α,IL-1,IL-6,IL-8含量變化及其臨床意義[J];中國臨床神經外科雜志;2006年01期

2 鐘春燕;胡志堅;;炎性體的研究進展[J];中國免疫學雜志;2012年03期

，

本文編號：731408