本文關(guān)鍵詞：甘草甜素抑制LPS誘導巨噬細胞表達和釋放HMGB1的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 高遷移率族蛋白B1(High mobility group box-1protein,HMGB1)是在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中起中心作用的遲發(fā)炎性細胞因子，可引起膿毒癥炎癥反應級聯(lián)放大，以其為靶分子治療膿毒癥具有廣闊的治療時間窗和良好的效果。甘草甜素(Glycyrrhizin,GL)是從傳統(tǒng)中草藥甘草中提取的一種有效成分，具有抗炎、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)的作用，在膿毒癥防治中具有潛在的誘人前景，但GL在膿毒癥中的治療作用尚罕見報道。本課題擬通過觀察GL對LPS誘導的巨噬細胞表達和釋放HMGB1的抑制作用，探討GL在膿毒癥中的治療作用。 方法： 分別采用100μg/L LPS、100μg/L LPS+1mmol/L GL刺激小鼠腹腔巨噬細胞株RAW264.7，于刺激后0、4、8、12、16、20、24和48h分別收集細胞培養(yǎng)上清，ELISA法檢測上清中HMGB1含量；提取各組培養(yǎng)細胞總RNA，實時熒光定量PCR檢測細胞中HMGBl的mRNA表達水平；分別提取各組細胞胞漿和胞核蛋白，Western blot檢測胞漿和胞核內(nèi)HMGBl蛋白的含量；免疫熒光、激光共聚焦顯微鏡觀察各組細胞內(nèi)HMGB1蛋白的含量變化和分布情況。 結(jié)果： LPS組細胞于刺激后8-48h細胞內(nèi)HMGB1mRNA轉(zhuǎn)錄水平逐漸增加，GL組細胞于刺激后8-16h HMGB1mRNA轉(zhuǎn)錄水平上升，與0h比較差異有顯著性(P0.01)；GL組于刺激后20-48h HMGB1mRNA轉(zhuǎn)錄水平逐漸下降；在相同的時間點，GL組細胞HMGB1mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著低于LPS組(P0.01)。 刺激前細胞胞漿HMGB1蛋白含量較少，胞核HMGB1蛋白含量較多。LPS組細胞于刺激后8-48h胞漿中HMGB1蛋白逐漸增多，GL組細胞于刺激后8-12h胞漿內(nèi)HMGB1蛋白明顯增加，與0h比較差異有顯著性(P0.01)；GL組于刺激后16-48h胞漿內(nèi)HMGB1蛋白含量降低至0h水平(P0.05)；在相同的時間點，細胞胞漿內(nèi)HMGB1蛋白含量顯著低于LPS組(P0.01)；LPS組和GL組細胞于刺激后8h胞核中蛋白開始增多，12-48h蛋白含量逐漸下降，與0h比較差異有顯著性(P0.01)；在相同時間點，GL組胞核內(nèi)HMGB1含量顯著低于LPS組(P0.01)。刺激前胞核呈強HMGB1綠色熒光，胞漿熒光較弱。LPS組于刺激后8h胞核內(nèi)綠色熒光開始減弱，胞漿內(nèi)綠色熒光開始增強，于12-24h胞核和胞漿均可觀察到逐漸增強的綠色熒光；GL組于刺激后8-12h觀察到胞核HMGB1有向胞漿轉(zhuǎn)位的趨勢，24h胞漿內(nèi)觀察不到綠色熒光；在相同時間點，GL組胞核內(nèi)綠色熒光強度均弱于LPS組。 LPS組和GL組細胞于刺激后8-48h培養(yǎng)上清中HMGB1含量逐漸上升，與0h比較差異有顯著性(P0.01)；在相同時間點，GL組上清中HMGB1含量顯著低于LPS組(P0.01)。 結(jié)論： 1.GL可以明顯抑制LPS誘導的HMGB1的轉(zhuǎn)位和釋放，降低LPS刺激后細胞培養(yǎng)上清中HMGB1的含量。 2.GL可明顯降低LPS誘導的HMGB1mRNA轉(zhuǎn)錄的水平，明顯抑制HMGB1蛋白的合成。 目的： 本研究擬通過觀察GL對LPS刺激后巨噬細胞內(nèi)NF-κB和AP-1信號通路相關(guān)分子表達的影響，探討GL抑制LPS誘導的巨噬細胞表達和釋放HMGB1的具體分子機制。 方法： 分別采用100μg/L的LPS、100μg/L的LPS+1mmol/L GL刺激RAW264.7細胞，于刺激后0、4、8、12、16、20、24和48h收集細胞培養(yǎng)上清，ELISA檢測TNF-α和IL-6含量；流式細胞儀檢測細胞表面TLR4/MD2受體的表達；Western blot檢測細胞中MyD88、磷酸化TAK-1、磷酸化p38MAPK、NF-κB p65的含量；免疫熒光、激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)NF-κB、AP-1的含量變化和分布情況。 結(jié)果： 刺激前細胞表面高表達TLR4/MD2受體；LPS組于刺激后4-8hTLR4/MD2受體表達顯著下降，12-48h TLR4/MD2受體表達逐漸升高，與0h比較差異有顯著性(P0.01)；GL組TLR4/MD2受體表達趨勢與LPS組類似；在相同時間點，，GL組TLR4/MD2受體表達均顯著低于LPS組（P0.01）。 刺激前MyD88、磷酸化TAK1和NF-κB p65蛋白表達均較低；LPS組于刺激后4-48h MyD88、磷酸化TAK1和NF-κB p65表達逐漸增高，GL組于刺激后12-48h MyD88、磷酸化TAK1和NF-κB p65表達逐漸增高，與0h比較差異有顯著性(P0.01)；在相同時間點，GL組MyD88、磷酸化TAK1和NF-κB p65表達均顯著低于LPS組(P0.01)；NF-κB熒光刺激前主要位于胞漿；LPS組于刺激后4-24h胞漿和胞核內(nèi)NF-κB熒光逐漸增強；GL組于刺激后4-24h胞漿熒光逐漸增強，胞核熒光不明顯；在相同時間點，GL組胞漿和胞核內(nèi)NF-κB熒光明顯弱于LPS組。 LPS組于刺激后8-48h磷酸化p38MAPK表達逐漸上升并維持在較高水平，與0h比較差異有顯著性(P0.01)；GL組于刺激后4-48h磷酸化p38MAPK表達與0h無差異(P0.05)；在相同時間點，GL組磷酸化p38MAPK表達顯著低于LPS組(P0.01)；刺激前AP-1亞基c-jun熒光主要位于胞核；LPS組和GL組于刺激后8-24h胞核熒光逐漸增強；在相同時間點，GL組胞核內(nèi)熒光強度明顯弱于LPS組。 LPS組于刺激后4-48h細胞培養(yǎng)上清內(nèi)IL-6和TNF-α含量逐漸上升，與0h比較差異有顯著性(P0.01)；GL組TNF-α和IL-6上升趨勢與LPS組類似，但在相同時間點，GL組上清中IL-6和TNF-α含量較LPS組明顯下降(P0.01)。 結(jié)論： 1.LPS通過TLR4/MD2→MyD88→TAK1→p38MAPK→AP-1這一信號通路誘導了HMGB1的表達和釋放。GL通過抑制上述各信號通路相關(guān)分子的活性抑制了LPS誘導的HMGB1的表達和釋放。 2.GL通過TLR4/MD2-NF-κB信號通路抑制了TNF-α和IL-6等早期炎癥信號分子的釋放，GL在后期通過抑制HMGB1的表達和釋放抑制了TNF-α和IL-6的瀑布樣釋放。
【關(guān)鍵詞】：甘草甜素 高遷移率族蛋白B1 抑制作用 NF-κB信號通路 高遷移率族蛋白B1 激活蛋白1
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R459.7
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-18
• 第一部分 甘草甜素對LPS誘導巨噬細胞表達和釋放HMGB1的抑制作用18-40
• 前言18-19
• 1 主要試劑及實驗儀器19-21
• 2 主要實驗方法21-30
• 3 統(tǒng)計學處理30
• 4 結(jié)果30-36
• 5 討論36-38
• 6 小結(jié)38-39
• 參考文獻39-40
• 第二部分 甘草甜素抑制LPS誘導巨噬細胞表達和釋放HMGB1的分子機制研究40-60
• 前言40-41
• 1 主要試劑及實驗儀器41
• 2 主要實驗方法41-43
• 3 統(tǒng)計學處理43
• 4 結(jié)果43-54
• 5 討論54-58
• 6 小結(jié)58
• 參考文獻58-60
• 文獻綜述60-69
• 參考文獻66-69
• 致謝69-70
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術(shù)論文目錄70-71

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 丁寧;肖慧;高巨;許立新;佘守章;;應用噬菌體展示技術(shù)篩選HMGB1啟動子結(jié)合蛋白[J];中國病理生理雜志;2010年01期

  本文關(guān)鍵詞：甘草甜素抑制LPS誘導巨噬細胞表達和釋放HMGB1的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：377316