膿毒癥(Sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合,可導(dǎo)致多器官功能障礙甚至死亡。膿毒癥是當(dāng)前重癥監(jiān)護病房(Intensive Care Unit,ICU)面臨的棘手難題,是除冠心病外ICU病人死亡的首要原因。一方面因為膿毒癥由不同的微生物引起,導(dǎo)致相應(yīng)的疫苗難以開發(fā);另一方面,由于抗生素的濫用,耐藥菌株不斷產(chǎn)生,應(yīng)用抗生素控制感染越發(fā)困難。因此,盡管對于膿毒癥的發(fā)病機制的研究取得了很大的進展,目前對于膿毒癥的治療,仍然沒有特效的藥物。所以,人們迫切需要發(fā)展新型的治療膿毒癥的方法。第一部分DUSP1啟動子熒光素酶報告基因RAW264.7細胞體系的建立以及測試絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶 1(Mitogen-activated protein kinase phosphatase 1,MKP-1)是一種可誘導(dǎo)的細胞核磷酸酶,能使絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPKs)去磷酸化,因此,它是MAPK活動的負性調(diào)控因子。研究發(fā)現(xiàn)MKP-1在固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中都是一個關(guān)鍵的內(nèi)源性負性調(diào)控因子,用敲除MKP-1的小鼠研究發(fā)現(xiàn)MKP-...

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一部分 DUSP1啟動子熒光素酶報告基因RAW264.7細胞體系的建立以及測試
    前言
    1.1 材料和方法
        1.1.1 主要試劑
        1.1.2 主要儀器
        1.1.3 RAW264.7細胞的培養(yǎng)
        1.1.4 pGL4.19/PrDUSP1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        1.1.5 挑陽性克隆,搖菌,提質(zhì)粒(用去內(nèi)毒素中提試劑盒)
        1.1.6 G418最佳濃度的篩選
        1.1.7 電轉(zhuǎn)染、細胞篩選和單克隆化
        1.1.8 熒光素酶活性檢測
        1.1.9 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄
        1.1.10 實時熒光定量PCR (RT-PCR)
        1.1.11 統(tǒng)計分析
    1.2 結(jié)果
        1.2.1 pGL4.19質(zhì)粒載體圖譜
        1.2.2 RAW264.7/PrDUSP1穩(wěn)定表達細胞的篩選
        1.2.3 穩(wěn)定表達細胞熒光素酶活性呈時間依賴性
        1.2.4 Rolipram可增加熒光素酶活性的表達
        1.2.5 Rolipram能上調(diào)RAW264.7細胞MKP-1 mRNA的表達
    1.3 討論
    參考文獻
第二部分 Rolipram對膿毒癥小鼠治療作用的研究
    前言
    2.1 材料和方法
        2.1.1 主要試劑
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 實驗動物
        2.1.4 RAW264.7細胞的培養(yǎng)
        2.1.5 細胞培養(yǎng)上清的收集
        2.1.6 LPS引起的膿毒癥小鼠生存率實驗
        2.1.7 小鼠血清、肺、肝和腎樣品收集
        2.1.8 細胞因子檢測
        2.1.9 石蠟切片和HE染色
        2.1.10 血清生化指標(biāo)檢測
        2.1.11 支氣管肺泡灌洗、灌洗液總細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)和總蛋白測定
        2.1.12 細胞總蛋白和組織總蛋白的提取與BCA蛋白定量
        2.1.13 Western-blot
        2.1.14 肺組織免疫熒光
        2.1.15 致病性大腸桿菌引起的膿毒小鼠生存率實驗
        2.1.16 CLP模型小鼠生存率實驗
        2.1.17 統(tǒng)計分析
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 Rolipram能抑制LPS引起的RAW264.7細胞培養(yǎng)上清中促炎細胞因子的釋放
        2.2.2 Rolipram能大幅提高LPS引起的膿毒癥小鼠的生存率
        2.2.3 Rolipram能降低LPS引起的膿毒癥小鼠血清中促炎細胞因子的生成
        2.2.4 Rolipram能減輕LPS引起膿毒癥小鼠的肺損傷
        2.2.5 Rolipram能減輕LPS引起的肝和腎功能損傷
        2.2.6 Rolipram能抑制小鼠肺中LPS引起的NF-κB信號通路的激活
        2.2.7 Rolipram能抑制小鼠肺中LPS引起的MAPK信號通路的激活
        2.2.8 Rolipram能大幅提高大腸桿菌引起的膿毒癥小鼠的生存率和CLP模型小鼠的生存率
    2.3 討論
    參考文獻
英文縮寫詞表
攻讀博士學(xué)位期間成果
致謝



本文編號：3740933