背景:百草枯（paraquat,PQ）是一種常被誤用的劇毒除草劑,尤其在發(fā)展中國(guó)家,因百草枯中毒死亡的現(xiàn)象非常常見(jiàn)。相較于PQ中毒引起的慢性肺纖維化的大量研究報(bào)道,急性大量PQ中毒引起的急性肺損傷背后的機(jī)制,仍然缺乏相應(yīng)的研究。在各種外界條件的刺激下,細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的改變和氧化應(yīng)激的產(chǎn)生,都與細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞死亡緊密相關(guān)。PQ被公認(rèn)可以引起氧化應(yīng)激的產(chǎn)生,但是否鈣離子參與其中的調(diào)控機(jī)制仍是未知的。近期有研究發(fā)現(xiàn),在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上一個(gè)功能多樣的鈣離子感受器——基質(zhì)相互作用分子1（STIM1）,能有效感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子濃度的變化從而發(fā)揮對(duì)細(xì)胞各項(xiàng)功能的調(diào)控作用。然而,STIM1在PQ誘導(dǎo)的急性肺中毒中的調(diào)節(jié)機(jī)制和作用仍然缺乏相應(yīng)的研究。本研究的目的是探討PQ誘導(dǎo)肺急性中毒的分子和細(xì)胞機(jī)制,從而能進(jìn)一步確定鈣信號(hào)和活性氧簇（ROS）是否參與調(diào)控機(jī)制的作用。方法:1.C57BL/6小鼠腹腔注射75mg/kg PQ處理48h構(gòu)建PQ急性中毒的在體模型,16HBE用于體外模型的構(gòu)建;2.LDH、MTT試劑盒以及臺(tái)盼藍(lán)染色用于檢測(cè)PQ處理用細(xì)胞死亡情況,TUNEL試劑盒用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;3.構(gòu)建STI... 

【文章來(lái)源】：南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省

【文章頁(yè)數(shù)】：69 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

PQ急性肺損傷模型肺組織HE染色（A），IL-6mRNA的表達(dá)（B），肺組織周期相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平變化

圖 2 PQ 引起細(xì)胞死亡，且隨劑量依賴性增加（A-C），細(xì)胞形態(tài)變化明顯（D），晚期以凋亡為主（E）臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞后，更為直觀地展示了細(xì)胞活性的占比情況（圖 2C）。如圖 2D，在顯微鏡下，明場(chǎng)視野拍攝清晰顯示大劑量 PQ 急性損傷，細(xì)胞逐漸失去原有的形態(tài)，細(xì)胞之間連接缺失，排布紊亂，大量細(xì)胞死亡漂浮不再貼壁。我們接下來(lái)使用了 TUNEL 染色分析了在 24h 和 48h PQ 處理后細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果如圖 2E 所示，處理 48h 后，綠色染色（凋亡細(xì)胞）和不規(guī)則形態(tài)的TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目明顯的增加，說(shuō)明 PQ 處理 48h 后引起了細(xì)胞核皺縮和大量細(xì)胞的凋亡，與此同時(shí)，我們并沒(méi)有觀察到對(duì)照組中有任何 TUNEL 陽(yáng)性的細(xì)胞。3. PQ 能夠引起細(xì)胞 S 期周期停滯根據(jù)以前的研究，細(xì)胞周期阻滯是抑制細(xì)胞增殖和導(dǎo)致細(xì)胞死亡（尤其是

31圖 3 PQ 處理后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞各周期分布（A），DAPI 染色分析細(xì)胞核直徑變化（B），細(xì)胞周期相關(guān)蛋白 mRNA 和蛋白水平變化（C-E）如圖 3A 所示，流式細(xì)胞術(shù)分析多次 PQ 處理結(jié)果。經(jīng)統(tǒng)計(jì)后，我們發(fā)現(xiàn) PQ處理實(shí)驗(yàn)組 16HBE 處于 G1 期的細(xì)胞數(shù)比例平均為 45.24%，明顯低于對(duì)照組的67.62%。與 G1 期的減少相反，實(shí)驗(yàn)組處于 S 期的細(xì)胞數(shù)比例平均為 47.90%，顯著高于對(duì)照組的 23.06%。此外，我們觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在 PQ 處理后有明顯的細(xì)胞核增大的趨勢(shì)，為進(jìn)行半定量的分析，我們通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行 DAPI 染色，使用熒光顯微鏡相同條件下拍攝單層照片，并使用 ImageJ 定量核的直徑。如圖 3B


本文編號(hào)：3487990