目的:NETs過度形成在膿毒癥、缺血再灌注損傷和腦卒中等急危重癥病理生理過程中的作用已經(jīng)被證實,但由于體內(nèi)NETs形成失調(diào)的機制十分復(fù)雜,目前尚無有效手段對其進(jìn)行干預(yù)。近年來,大量研究發(fā)現(xiàn)血小板激活失調(diào)是體內(nèi)NETs過度形成的重要誘導(dǎo)因素。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)HDAC抑制劑可以削弱膿毒癥休克小鼠血清NETs標(biāo)記物的升高,另有研究發(fā)現(xiàn)HDAC參與血小板激活。因此,本課題嘗試建立激活血小板誘導(dǎo)NETs形成的技術(shù)體系,為進(jìn)一步揭示血小板激活和NETs形成的內(nèi)在聯(lián)系提供技術(shù)支持,同時評估HDAC抑制劑對激活血小板分泌和NETs誘導(dǎo)能力的影響,探索HDAC抑制劑器官功能保護作用的機制。研究方法:采集健康人靜脈血,分離新鮮血小板和中性粒細(xì)胞。分離所得血小板在體外用血小板激活劑預(yù)處理,而后將預(yù)處理血小板和中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)以誘導(dǎo)NETs形成。在培養(yǎng)基中加入細(xì)胞外核酸染料Sytox green,于培養(yǎng)期間持續(xù)重復(fù)測量懸液中Sytox green的熒光強度。用測得數(shù)據(jù)建立熒光強度-時間動力曲線以對NETs形成進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測和定量分析。利用活細(xì)胞顯像和免疫熒光技術(shù)對NETs形成進(jìn)行定性分析。通過比較熒光強度隨... 

【文章來源】：中國醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

激活血小板誘導(dǎo)NETs形成技術(shù)體系的示意圖

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文62.3.2標(biāo)本采集靜脈血標(biāo)本來自于面向社會招募的健康成年志愿者。志愿者的納入標(biāo)準(zhǔn)如下：年齡18至50周歲；無再生障礙性貧血或粒細(xì)胞缺乏癥等血液系統(tǒng)疾病史；無系統(tǒng)性紅斑狼瘡或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病史；無艾滋病或梅毒等傳染性疾病史；無糖尿病或庫欣病等內(nèi)分泌疾病史；無高血壓或冠心病等心血管病史；無腫瘤病史；無免疫抑制治療病史；自愿簽署知情同意書。志愿者的排除標(biāo)準(zhǔn)如下：年齡小于18周歲或大于50周歲；有上述疾病史；近2周內(nèi)患感染性疾��；近1月內(nèi)服用過抗血小板或抗凝藥物；不簽署知情同意書。招募入組的志愿者根據(jù)個人意愿接受1至5次靜脈采血，每次采血6至18ml，具體量由當(dāng)日所需進(jìn)行的實驗而定，靜脈穿刺采血由中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科的專業(yè)醫(yī)護人員完成，操作過程均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化。具體如下：醫(yī)護人員先對志愿者進(jìn)行肘正中靜脈穿刺，穿刺后用EDTA抗凝管或檸檬酸抗凝管收集靜脈血，采集的靜脈血立即用于中性粒細(xì)胞或血小板的分離。2.3.3中性粒細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)圖2中性粒細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)的流程圖利用密度梯度離心法分離中性粒細(xì)胞，根據(jù)不同實驗進(jìn)行相應(yīng)條件的體外培養(yǎng)（圖2）。具體如下：用水浴鍋將4℃保存的Hisopauqe-1119預(yù)熱到28℃，而后加入6mlHistopaque-1119到無菌15ml離心管中。取Percoll原液，按9:1（Percoll

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文82.3.4血小板的分離和體外培養(yǎng)圖3血小板分離和體外培養(yǎng)的流程圖利用離心法分離血小板，根據(jù)不同實驗進(jìn)行相應(yīng)條件的體外培養(yǎng)（圖3）。具體如下：用檸檬酸抗凝管收集靜脈血，而后按10:1.5（全血:ACD-A抗凝劑，體積:體積）向抗凝血中加入無菌的ACD-A抗凝劑并輕柔混勻。用300×g離心10min，離心時使用緩慢升速和無阻力減速模式。離心后收集上層富血小板血漿到一無菌10ml離心管中。用450×g離心5min，離心時使用緩慢升速和無阻力減速模式。離心后棄上清，用預(yù)先加入10mMHEPES的RPMI1640培養(yǎng)基重懸底部血小板團塊。用血常規(guī)儀檢測所得血小板懸液濃度和純度，而后將血小板懸液濃度調(diào)整到100×106cell/ml。將同一志愿者的血小板懸液分為數(shù)份，而后分別加入對應(yīng)刺激物，具體如下：PLT+TRAP組加入50μM（最終濃度）TRAP-6，PLT+TRAP+SAHA組加入50μM（最終濃度）TRAP-6和10mM（最終濃度）SAHA，PLT組不加刺激物。加完刺激物后用培養(yǎng)基將各組體積補齊以保持血小板濃度一致，而后將標(biāo)本放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用37℃、5%CO2培養(yǎng)30min。2.4標(biāo)本檢測2.4.1動態(tài)監(jiān)測DNA釋放按前述方法準(zhǔn)備標(biāo)本，完成后向細(xì)胞懸液中加入1.25μM（最終濃度）Sytoxgreen，再按10^5cell/孔（中性粒細(xì)胞數(shù)）將混合細(xì)胞懸液種入黑壁底透的96孔板中。種植后將標(biāo)本轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)儀中，設(shè)置37℃恒溫培養(yǎng)2h（PMA誘導(dǎo)NETs的實驗時為3h）。在培養(yǎng)期間，用485nm的激發(fā)光重復(fù)測量各孔內(nèi)的熒光強度，

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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