本文關(guān)鍵詞：以膠原水凝膠為支架體外構(gòu)建肝細胞三維共培養(yǎng)系統(tǒng)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【背景】急性肝衰竭病程進展迅速，病死率高，肝移植被認為是唯一有效的治療手段，但供肝嚴重缺乏。人工肝支持系統(tǒng)可有效替代急性肝衰竭患者的肝臟功能，為肝細胞再生及等待肝源提供時間，協(xié)助患者順利度過肝衰期，最終降低肝衰竭患者死亡率。近年來，多種生物人工肝(BAL)相繼被研發(fā)并在臨床應(yīng)用，因不僅具有解毒作用，還有肝細胞的合成、代謝功能，在肝衰竭治療上顯示出極大的優(yōu)越性。但目前研發(fā)的BAL尚不能充分模擬體內(nèi)肝臟微環(huán)境，肝細胞在體外培養(yǎng)及治療過程中易失去活性及功能，嚴重影響治療效果。因此，改善肝細胞培養(yǎng)體系，使BAL中肝細胞長期維持活性及功能是達到理想治療效果的關(guān)鍵。膠原水凝膠支架因含水量高、氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)及代謝廢物容易運輸、液固轉(zhuǎn)換、生物相容性好、制作工藝簡單以及易于交聯(lián)可溶性生長因子等優(yōu)點而廣泛應(yīng)用于細胞三維培養(yǎng)，前期結(jié)果也證實將肝細胞在膠原水凝膠中三維培養(yǎng)可顯著延長其白蛋白及尿素分泌水平。而將肝細胞與其它細胞共培養(yǎng)也可顯著促進肝功能維持。因此，本文聯(lián)合三維培養(yǎng)、添加生長因子及共培養(yǎng)三種方式促進肝細胞功能維持，將肝細胞及NIH/3T3成纖維細胞接種于預(yù)混肝細胞生長因子(HGF)的膠原水凝膠中構(gòu)建肝細胞三維共培養(yǎng)系統(tǒng)，并對此培養(yǎng)體系進行進一步優(yōu)化及功能驗證，為構(gòu)建有效的BAL奠定基礎(chǔ)。 【目的】聯(lián)合使用膠原水凝膠、HGF及NIH/3T3成纖維細胞體外構(gòu)建能夠長時間有效維持肝細胞活性及功能的肝細胞三維共培養(yǎng)系統(tǒng)。 【方法】(1)將SD大鼠原代肝細胞及NIH/3T3成纖維細胞與預(yù)混HGF及DMEM的液態(tài)I型膠原混合構(gòu)建肝細胞三維共培養(yǎng)系統(tǒng)，通過相差顯微鏡、HE染色、糖原(PAS)染色、免疫熒光染色等方法對培養(yǎng)肝細胞的形態(tài)、表型、白蛋白及糖原合成功能進行初步檢測。(2)為進一步優(yōu)化培養(yǎng)系統(tǒng)，在膠原水凝膠支架中分別混合五種不同比例的肝細胞與NIH/3T3成纖維細胞(H:F為1:0.5、1:1、1:2、1:4及1:8)、接種四種不同濃度的細胞混懸液(2×104/mL,2×105/mL,2×106/mL and2×107/ml)后連續(xù)培養(yǎng)25天，收集培養(yǎng)液上清，比較各組中肝細胞的白蛋白及尿素合成水平變化，篩選出最佳的培養(yǎng)條件，然后采用三種不同培養(yǎng)方式(單獨培養(yǎng)，插入培養(yǎng)，共培養(yǎng))進行培養(yǎng)，評估共培養(yǎng)細胞之間的直接接觸作用或間接作用，從而確定最佳的培養(yǎng)方式。(3)使用最優(yōu)化條件構(gòu)建肝細胞三維共培養(yǎng)系統(tǒng)后連續(xù)培養(yǎng)肝細胞25天，在不同時間點通過LIVE/DEAD染色、WST-1試驗檢測細胞活性，并對肝細胞功能維持(白蛋白及尿素分泌、LDL攝取)、肝細胞特異基因表達水平等進行檢測。 【結(jié)果】(1)肝細胞/膠原水凝膠復(fù)合物呈凝膠狀懸浮培養(yǎng)于培養(yǎng)板中，相差顯微鏡下觀察可見細胞呈圓形，以三維立體方式均勻分散在膠原水凝膠中；培養(yǎng)7天后，HE染色可見肝細胞聚集生長，成纖維細胞則圍繞肝細胞生長，CK18染色陽性說明肝細胞未逆分化，仍保持成熟肝細胞表型，，并且PAS染色及白蛋白免疫熒光染色陽性，提示細胞仍具有糖原及白蛋白合成功能。(2)按照H:F為1:0.5、1:1、1:2、1:4及1:8接種，檢測培養(yǎng)液上清中白蛋白及尿素分泌含量結(jié)果顯示，培養(yǎng)后分泌水平逐漸上升，到第5或7天時達到高峰，后隨培養(yǎng)時間延長逐漸下降，但H:F為1:0.5組在20天內(nèi)白蛋白及尿素分泌含量仍分別維持在30-50μg/24h,40-110μg/24h的較高水平，與其它組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)；接種四種不同細胞密度后，細胞接種密度2×106/ml組白蛋白分泌及尿素合成能力最強，增加或減少細胞密度對肝細胞的功能沒有明顯作用，并且第7天的分泌含量與其余各組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；將細胞采用三種方式培養(yǎng)，在培養(yǎng)第3天，各組白蛋白與尿素分泌含量無明顯差異，而在第7和第20天，共培養(yǎng)組的白蛋白分泌含量與單獨培養(yǎng)組及插入培養(yǎng)組相比明顯升高，第7天分別升高2.10及1.46倍，第20天分別升高4.58及1.75倍，尿素合成與白蛋白分泌趨勢類似。(3)使用最優(yōu)化條件培養(yǎng)肝細胞后，與單獨培養(yǎng)組相比，共培養(yǎng)組細胞存活率顯著升高(分別為52.25±4.62%及32.92±5.32%, P0.01,第20天)，白蛋白分泌、尿素合成及LDL攝取能力增強，肝細胞特異基因表達(Albumin, HNF-4α, Claudin-3及G6P)明顯升高(P0.05)，并且肝藥酶誘導(dǎo)效果顯著，在誘導(dǎo)后CYP2E1表達明顯升高，與單獨培養(yǎng)相比結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異，而CYP1A2, CYP2B2及CYP3A1在誘導(dǎo)后穩(wěn)定表達，CYP1A1則下降。 【結(jié)論】以膠原水凝膠為支架成功構(gòu)建了肝細胞三維共培養(yǎng)系統(tǒng)。按照肝細胞與成纖維細胞比例為1:0.5、細胞密度為2×106/ml在膠原水凝膠中接種細胞并采用共培養(yǎng)細胞直接接觸的培養(yǎng)方式可最大程度發(fā)揮肝細胞功能，這些參數(shù)可以為制備BAL提供參考。這種肝細胞共培養(yǎng)并復(fù)合細胞外基質(zhì)及生長因子的培養(yǎng)模式可以最大程度的模擬肝臟微環(huán)境，在結(jié)構(gòu)上更類似肝臟組織，并能在更長時間內(nèi)有效維持肝細胞活性以及合成代謝等各方面功能。
【關(guān)鍵詞】：生物人工肝 肝細胞 細胞培養(yǎng) 水凝膠 I型膠原 三維培養(yǎng) 共培養(yǎng) 生物材料 細胞外基質(zhì)材料
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R575.3
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-14
• 文獻回顧14-24
• 第一部分 肝細胞三維共培養(yǎng)系統(tǒng)的建立24-35
• 1 材料和儀器24-27
• 2 方法27-30
• 3 結(jié)果30-32
• 4 討論32-35
• 第二部 肝細胞三維共培養(yǎng)體系的優(yōu)化35-49
• 1 材料35-36
• 2 方法36-41
• 3 結(jié)果41-46
• 4 討論46-49
• 第三部 肝細胞三維共培養(yǎng)系統(tǒng)的功能驗證49-59
• 1 材料和儀器49-51
• 2 方法51-53
• 3 結(jié)果53-57
• 4 討論57-59
• 小結(jié)59-60
• 參考文獻60-70
• 個人簡歷和研究成果70-71
• 致謝71

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 Robert AFM Chamuleau;;Future of bioartifi cial liver support[J];World Journal of Gastrointestinal Surgery;2009年01期

2 趙云山;徐迎新;張博峰;吳欣;劉巨超;張?zhí)m;唐利安;黃志強;;以膠原凝膠為支架構(gòu)建可植入工程化肝組織的實驗研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2007年29期

3 ;The development of a new bioartificial liver and its application in 12 acute liver failure patients[J];World Journal of Gastroenterology;2003年04期

  本文關(guān)鍵詞：以膠原水凝膠為支架體外構(gòu)建肝細胞三維共培養(yǎng)系統(tǒng)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：313011