間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell,MSC),是來源于胚胎早期中胚層的一類多能成體干細胞。絕大多數(shù)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如顱腦創(chuàng)傷(traumatic brain injury,TBI),脊髓損傷、腦卒中、神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,主要的發(fā)病原因或發(fā)病機理為神經(jīng)細胞的變性、凋亡、損傷或死亡。神經(jīng)細胞的及時、有效的補充對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預防和治療尤為重要。當前基礎(chǔ)和臨床研究均顯示,MSC具有向神經(jīng)系統(tǒng)細胞分化的潛能,可以向受損的神經(jīng)組織中遷移、歸巢、生存、增殖和向神經(jīng)細胞分化成為神經(jīng)樣細胞,為TBI的治療提供“種子細胞”,從而改善患者的神經(jīng)系統(tǒng)功能,改善患者生存狀態(tài)和預后。因MSC本身免疫原性極低,在神經(jīng)系統(tǒng)可視為免疫豁免,因此其可作為一種理想的“種子細胞”干預TBI,提高患者的生存質(zhì)量。臍帶來源廣、變廢為寶,本研究所選擇的MSC為人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)。本研究的目的是為了探討hUC-MSCs移植治療TBI的療效、作用機制、安全性以及蛋白質(zhì)組學變化情況,為hUC-MSCs臨床治療TBI提供理論支持和臨床經(jīng)驗。本研究中將45只雄性SD大鼠隨機分為3組:對照組、TBI模型組以及TBI干細胞治療組,每組15只,利用電子大腦皮質(zhì)挫傷撞擊儀建立TBI大鼠模型,TBI干細胞治療組大鼠經(jīng)尾靜脈給予0.1ml hUC-MSCs懸液和0.1ml生理鹽水,對照組及TBI模型組給予0.2ml生理鹽水,利用PCR、Western Blot、免疫組化以及ELISA檢測,分別檢測腦組織中和血清中白細胞介素-12(interleukin-12,IL-12)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的表達情況,并進行比較,發(fā)現(xiàn)TBI干細胞治療組腦組織中IL-12 mRNA和蛋白表達水平明顯下調(diào),SOD mRNA和蛋白表達水平明顯上調(diào),血清中IL-12濃度顯著降低,免疫組化結(jié)果也證實了腦組織中SOD表達水平上調(diào)。為了驗證hUC-MSCs移植治療TBI的療效、細胞移植方式和安全性,本研究通過回顧性分析原武警后勤學院附屬醫(yī)院神經(jīng)重癥科自2015年4月至2015年11月收治的24例重型TBI患者的臨床資料,分為常規(guī)治療組和hUC-MSCs治療組,比較常規(guī)治療組與hUC-MSCs治療組患者性別、年齡、致傷原因等基本臨床資料,比較兩組患者入院時、傷后1個月及3個月GCS評分,比較兩組患者住院時間及傷后6個月GOS評分,觀察hUC-MSCs治療組不良反應(yīng)事件,發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs治療組在傷后3個月GCS評分、傷后6個月GOS評分以及住院時間均顯著優(yōu)于常規(guī)治療組,移植治療期間以及后期的隨訪過程中,無明顯不良事件發(fā)生。為了更深層次探討hUC-MSCs治療急性TBI的分子機制,本研究采用數(shù)據(jù)非依賴采集技術(shù)進行數(shù)據(jù)采集,對經(jīng)hUC-MSCs治療前后的腦脊液進行生物信息學處理,經(jīng)過嚴格的定量多肽以及子離子篩選,本實驗共鑒定到722個蛋白,其中對633個蛋白進行了可靠的定量分析,篩選到hUC-MSCs治療前后發(fā)生改變的42種差異蛋白,其中上調(diào)蛋白有29種,下調(diào)的蛋白有13種,主要包括白介素(IL-6、IL-12)、神經(jīng)穿透素、過氧化物酶、神經(jīng)生長因子等。對篩選到的差異蛋白進行GO分析、KEGG Pathway分析、蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖分析以及聚類分析,發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白的改變主要表現(xiàn)在對應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、軸突重塑以及血管重建方面。經(jīng)本實驗研究證明:hUC-MSCs移植后,通過下調(diào)IL-12,控制炎癥反應(yīng);同時通過上調(diào)SOD,有效的抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),減少對受損腦組織的二次傷害;hUC-MSCs移植治療重型TBI,可改善患者預后,縮短住院時間;多次、多途徑、序貫式的hUC-MSCs移植治療TBI是一種行之有效且安全性高的治療方法;hUC-MSCs移植治療TBI的作用機理可能為改善應(yīng)激反應(yīng)、進行免疫調(diào)節(jié)、改善機體微環(huán)境、促進軸突再生重塑以及血管再生重建;通過細胞替代治療與“偽旁觀者作用”共同發(fā)揮作用,在一定程度上修復損傷腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu),同時通過旁分泌或自分泌作用分泌具有生物活性的物質(zhì),促進恢復神經(jīng)系統(tǒng)功能。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R651.15
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略語/符號說明
前言
    研究現(xiàn)狀、成果
    研究目的、方法
一、hUC-MSCs移植對急性TBI大鼠超氧化物歧化酶及白細胞介素-12 的影響
    1.1 材料與方法
        1.1.1 hUC-MSCs的分離、培養(yǎng)及質(zhì)量控制
        1.1.2 TBI模型的建立
        1.1.3 干預及檢測
        1.1.4 RT-PCR檢測腦組織中IL-12及SOD的 mRNA的變化
        1.1.5 Western Blot檢測腦組織中IL-12及SOD蛋白的變化
        1.1.6 免疫組化
        1.1.7 血清IL-12 的測定
        1.1.8 統(tǒng)計學處理
    1.2 結(jié)果
        1.2.1 IL-12及SOD mRNA的表達情況
        1.2.2 IL-12及SOD蛋白水平的表達情況
        1.2.3 各組腦組織SOD表達的差異情況（免疫組化）
        1.2.4 各組血清中IL-12 濃度差異情況（ELISA檢測）
    1.3 討論
    1.4 小結(jié)
二、hUC-MSCs移植治療急性TBI的臨床研究
    2.1 資料與方法
        2.1.1 臨床資料
        2.1.2 治療方法
        2.1.3 hUC-MSCs的分離、培養(yǎng)、質(zhì)量控制和移植
        2.1.4 觀察指標
        2.1.5 統(tǒng)計學方法
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 hUC-MSCs形態(tài)觀察
        2.2.2 流式細胞術(shù)檢測hUC-MSCs單細胞懸液表面標志物
        2.2.3 兩組患者基本臨床資料對比
        2.2.4 兩組患者治療后GCS評分及GOS評分對比
        2.2.5 兩組患者住院時間對比以及不良反應(yīng)事件
        2.2.6 典型病例
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
三、TBI患者經(jīng)hUC-MSCs治療后腦脊液蛋白組學的變化
    3.1 對象和方法
        3.1.1 樣本信息
        3.1.2 樣本分組及處理
        3.1.3 CSF蛋白提取與處理
        3.1.4 液相-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）檢測
        3.1.5 DDA數(shù)據(jù)采集——數(shù)據(jù)庫構(gòu)建
        3.1.6 DIA數(shù)據(jù)采集——定量數(shù)據(jù)采集
        3.1.7 DIA定量分析
        3.1.8 主要數(shù)據(jù)指標
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 譜圖庫構(gòu)建
        3.2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)量評估
        3.2.3 定量多肽與子離子挑選
        3.2.4 定量分析
        3.2.5 GO分析
        3.2.6 KEGG分析
        3.2.7 蛋白之間的相互作用
        3.2.8 聚類分析
        3.2.9 差異蛋白表達
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
全文結(jié)論
論文創(chuàng)新點
參考文獻
發(fā)表論文和參加科研情況說明
綜述 間充質(zhì)干細胞研究與應(yīng)用進展
    綜述參考文獻
致謝
個人簡歷

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本文編號：2884610