研究背景目前皮膚移植仍然是救治大面積深度燒傷、嚴(yán)重創(chuàng)傷的關(guān)鍵措施之一,對于大面積深度燒傷的患者來說,能否盡早地封閉創(chuàng)面關(guān)系到其預(yù)后。盡早封閉創(chuàng)面可以減少創(chuàng)面滲出和體液、營養(yǎng)物質(zhì)的流失,降低感染發(fā)生的幾率,縮短治療時間以及減輕患者的痛苦及經(jīng)濟(jì)壓力,提高病患的存活率及其以后的生活質(zhì)量。封閉皮膚缺損創(chuàng)面的最好方法是自體皮膚移植,但是大面積燒傷或創(chuàng)傷常常會造成患者自身皮膚來源嚴(yán)重缺乏,無法滿足燒傷所致大面積皮膚缺損的需要,這也是導(dǎo)致重度燒傷患者殘疾或死亡的最重要因素。異種或同種異體皮膚移植雖然可以暫時解決創(chuàng)面的短期覆蓋問題,但是由于皮膚是抗原性最強的組織之一,機(jī)體對移植物具有強烈的免疫排斥反應(yīng),致使皮膚移植后存活時間較短。異種或同種異體皮膚移植后機(jī)體對移植物的排斥反應(yīng)在治療效果方面是消極的。免疫抑制劑用于治療器官移植排斥反應(yīng),可明顯延長移植物存活時間,但是免疫抑制劑具有顯著的副作用,長期使用免疫抑制劑可導(dǎo)致器官損傷,降低機(jī)體的抗感染和抗腫瘤能力,導(dǎo)致急性感染甚至癌癥,所以免疫抑制劑的應(yīng)用受到限制。另外,大面積燒傷的患者常伴有全身感染,這種情況下免疫抑制劑也是慎重應(yīng)用的。因此,如何在不應(yīng)用免疫抑制劑的前提下延長異種或異體皮的存活時間是目前比較棘手的問題。在這種情況下,誘導(dǎo)免疫耐受便顯得尤為重要,移植耐受性是同種異體移植物在沒有應(yīng)用免疫抑制劑的情況下移植物保持穩(wěn)定功能而未被受體排斥,但對第三方的免疫反應(yīng)保持完整。對于大面積燒傷患者,如果在不應(yīng)用免疫抑制劑的前提下采用異種或同種異體皮膚封閉其創(chuàng)面而不發(fā)生免疫排斥反應(yīng),達(dá)到免疫耐受的狀態(tài),不僅能夠盡早使創(chuàng)面愈合,減輕其經(jīng)濟(jì)壓力,還能減少瘢痕攣縮所造成的畸形,提高患者的生活質(zhì)量。因此如何誘導(dǎo)這種免疫耐受是組織器官移植研究道路上亟需解決的問題。目前間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSCs)是醫(yī)學(xué)研究的一大熱點。MSCs是一群中胚層來源的具有多向分化潛能和自我更新能力的成體干細(xì)胞,在組織再生和修復(fù)醫(yī)學(xué)中有著十分廣闊的應(yīng)用前景。MSCs可以從成體多種組織,如脂肪、骨髓、滑膜、牙髓、胎盤、羊水、臍帶血、胎肺、胎肝甚至經(jīng)血中分離獲得,其分離方法簡便,體外擴(kuò)增迅速、方便,且不涉及倫理問題,這使得MSCs成為細(xì)胞治療首選的種子細(xì)胞。另外MSCs已被廣泛證實具有免疫調(diào)節(jié)作用,雖然機(jī)制尚不明確,但由于其具有明確的免疫抑制和誘導(dǎo)免疫耐受的作用,促使眾多學(xué)者將MSCs應(yīng)用于誘導(dǎo)同種異體移植免疫耐受的研究當(dāng)中,并顯示MSCs在治療自身免疫性疾病及器官移植領(lǐng)域具有巨大的潛能。2002年,B artholomew A等研究發(fā)現(xiàn)單純輸注異基因甚至第三方的MSCs可以延長狒狒的皮膚移植物存活時間,為解決異種或異體皮膚移植排斥提供了新的選項。之后,Lee SM等人研究顯示:條件培養(yǎng)基或脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose derived mesenchymal stem cell,ADSCs)輸注與對照組相比可明顯延長同種異體移植皮膚的存活時間,并指出ADSCs及其分泌的細(xì)胞因子具有誘導(dǎo)免疫耐受的可能性。大量關(guān)于預(yù)處理的MSCs用以提高其在免疫抑制作用和誘導(dǎo)免疫耐受能力的研究實驗正在如火如荼的開展著。相關(guān)研究表明,MSCs結(jié)合基因轉(zhuǎn)染、藥物或細(xì)胞因子處理的方法可能提高其誘導(dǎo)免疫耐受的能力。例如,Bian L等實驗結(jié)果顯示肝細(xì)胞生長因子轉(zhuǎn)染的MSCs可明顯延長大鼠同種異體移植皮膚的存活時間。Zhang Y等實驗證實與未處理的MSCs相比,Stro-1(+)MSCs可以大大延長大鼠皮膚移植物的存活時間。白介素17(interleukin-17,IL-17)主要由Th17細(xì)胞分泌產(chǎn)生,另外還可產(chǎn)生于NKT(natural killer T)細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞,其不僅在免疫活化中起到重要作用,而且還參與了腫瘤、感染免疫以及免疫性疾病的進(jìn)程,如自身免疫性肝炎等。IL-17還具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化,促進(jìn)多種細(xì)胞因子和趨化因子的釋放,招募中性粒細(xì)胞的作用,在炎癥疾病中,其水平在組織和血清中會明顯增高,因此被認(rèn)為是最強有力的炎癥細(xì)胞因子之一。但是有意思的是最近多項研究發(fā)現(xiàn)IL-17可增強MSCs的免疫抑制作用,而非促進(jìn)炎癥的發(fā)生、逆轉(zhuǎn)MSCs的免疫抑制作用。本實驗擬通過將IL-17預(yù)處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)注射至同種異體皮膚移植模型小鼠體內(nèi),探討IL-17增強BMSCs誘導(dǎo)異體皮膚移植免疫耐受能力并延長同種異體皮膚存活時間的可行性。研究目的通過白介素17對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制淋巴細(xì)胞增殖作用影響的體外實驗以及白介素17對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)同種異體皮膚移植免疫耐受影響的動物實驗,檢驗并證實BMSCs是否具有誘導(dǎo)免疫耐受,延長受體小鼠移植皮膚存活時間的作用,探討IL-17可否增強BMSCs誘導(dǎo)免疫耐受并延長同種異體皮膚移植的皮膚存活時間,通過該實驗初步探索IL-17增強BMSCs免疫抑制作用而達(dá)到誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制。研究方法1.BMSCs的分離,培養(yǎng)和鑒定脊椎脫臼法處死Balb/c小鼠,分離雙側(cè)股骨、脛骨和肱骨,體外通過沖洗股骨、脛骨和肱骨骨髓腔,從中分離骨髓細(xì)胞,過濾細(xì)胞懸浮液后,離心,吸棄上清液,用所配制的低糖DMEM完全培養(yǎng)液重懸后在5%CO2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過其多向誘導(dǎo)分化的能力和表面標(biāo)志性抗原檢測來鑒定BMSCs:BMSCs常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞達(dá)90%融合時,分別進(jìn)行成骨、成軟骨和成脂培養(yǎng),成骨、成軟骨和成脂誘導(dǎo)及相應(yīng)對照組分別以茜素紅S、阿利辛藍(lán)及油紅O染料進(jìn)行著色鑒定。BMSCs進(jìn)行體外培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%融合時消化,離心棄上清,磷酸鹽緩沖液(phosphatic buffer solution,PBS)洗滌2遍后重懸制成5×105個細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液,分裝至樣品管中,分別加入抗小鼠單克隆抗體Anti-CD31-FITC,Anti-CD117-FITC 及Anti-CD29-FITC,Anti-CD44-FITC,放置于4℃冰箱,避光孵育30分鐘;離心、洗滌,流式上機(jī)檢測。2.IL-17對BMSCs的預(yù)處理取BMSCs 2×105個接種于25cm2培養(yǎng)瓶中,24小時后更換培養(yǎng)基,將IL-17加入培養(yǎng)基中(終濃度為50ng/ml)。每天觀察處理后的BMSCs的形態(tài)及生長趨勢。5天后去除培養(yǎng)基,胰酶消化收集IL-17預(yù)處理的BMSCs(BMSCs pretreated with IL-17,BMSCs-17)用于實驗。3.淋巴細(xì)胞增殖抑制實驗胰酶消化收集BMSCs、BMSCs-17,10%FBS的DMEM低糖完全培養(yǎng)基重懸,計數(shù),將之調(diào)節(jié)并獲取不同的細(xì)胞濃度的BMSCs、BMSCs-17,各取100微升與100微升的刀豆蛋白A(concanavalinA,ConA)刺激后的脾淋巴細(xì)胞在96孔板中共培養(yǎng),用MTT法檢測淋巴細(xì)胞的增殖情況。4.BMSCs 的CM-Dil 標(biāo)記CM-Dil用質(zhì)量濃度為100%的DMSO溶解制成1.0m g/mL工作液并過濾。取第4-8代融合度為90%的BMSCs,在25cm2培養(yǎng)瓶中加人5 μg/mL CM-Dil溶液(由5μL工作液溶于1 mL PBS制得)2～3 mL。37℃,5%CO2孵育處理5min,4℃下孵育20min;吸棄CM-DiI溶液,加入10%FBS低糖DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),觀察其生長狀態(tài)及傳代后熒光標(biāo)記情況。5.異體皮膚移植模型的建立麻醉BALB/C小鼠,俯臥位固定小鼠四肢,在供體背部獲得全層皮膚,并修剪成大小為1.5×1.5 cm2全厚皮片置于生理鹽水紗布中備用。在受體C57BL/6J小鼠麻醉后俯臥位固定四肢,在其背部人為形成1.5×1.5 cm2的皮膚缺損區(qū),將BALB/C小鼠全厚皮片植于C57BL/6J小鼠背部創(chuàng)面上,留長線備打包,創(chuàng)面依次油紗,棉球覆蓋,打包固定,單籠飼養(yǎng)。6.細(xì)胞輸注與實驗分組體外擴(kuò)增培養(yǎng)BALB/C小鼠BMSCs,取第4-8代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實驗。實驗組用IL-17預(yù)處理的BALB/C小鼠BMSCs。于術(shù)前一天自C57BL/6J尾靜脈注射BALB/C小鼠BMSCs后進(jìn)行異體皮膚移植。移植后5天打開包堆觀察移植皮膚成活情況及體內(nèi)免疫狀態(tài)的變化。將C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為3組:①實驗分組如下:A組尾靜脈注射PBS,異體皮膚移植;B組尾靜脈注射MSCs,異體皮膚移植;C組尾靜脈注射BMSCs-17,異體皮膚移植。7.BMSCs的CM-DiI示蹤將CM-Dil標(biāo)記后的BMSCs以及BMSCs-17沿C57BL/6J小鼠尾靜脈注入體內(nèi)后行異體皮膚移植,于術(shù)后第7天切取移植物行冰凍切片,冷丙酮固定,抗熒光衰減封片劑封片后,熒光顯微鏡下觀察BMSCs去向。8.移植皮膚的外觀及組織學(xué)觀察于術(shù)后第5天打開包堆后開始觀察C57BL/6J小鼠移植皮膚的外觀,并同時記錄各組各只小鼠移植皮膚的存活時間。皮膚如果有90%結(jié)痂則定義為壞死,如果移植皮膚完全發(fā)黑、變硬并脫落定義為排斥;于術(shù)后第7天取C57BL/6J小鼠移植皮膚行HE染色光鏡下觀片。9.受體小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測移植術(shù)后第7天取受體C57BL/6J小鼠脾臟制備單細(xì)胞懸液,用小鼠Regulatory T Cell試劑盒按其說明書步驟檢測術(shù)后受體C57BL/6J小鼠調(diào)節(jié)T細(xì)胞(T regulation cells,Treg cells)細(xì)胞的含量。10.受體C57BL/6J小鼠細(xì)胞因子(IL-10、IFN-γ、TGF-β)的檢測應(yīng)用摘眼球法在術(shù)后第7天采取受體C57BL/6J小鼠靜脈血,室溫靜置10-20min,2000-3000rpm離心20min,仔細(xì)收集上清,置于-20℃保存。按照IL-10、IFN-γ、TGF-βELISA試劑盒說明書的步驟檢測小鼠IL-10、IFN-γ、TGF-β含量。結(jié)果1.BMSCs貼壁生長,呈梭形,極性排列,旋渦狀。BMSCs具有多向分化的潛能,可以在特定的分化培養(yǎng)基中分化為成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞;BMSCs高表達(dá)表面抗原CD29(99.24%)和CD44(99.67%),而不表達(dá)造血干細(xì)胞表面特異性抗原CD31(0.35%)和CD117(0.27%)。2.在體外實驗中,BMSCs能夠顯著抑制T淋巴細(xì)胞增殖(經(jīng)ConA刺激增殖),而不受主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)的限制,另外,這種抑制作用隨著BMSCs細(xì)胞濃度的增加而增強。3.各檢測及觀察指標(biāo)結(jié)果如下:(1)移植皮片的存活時間對照組為11.8±0.834天,BMSCs組為15.8±0.783天,BMSCs-17組存活時間明顯延長至19.2±1.012天。BMSCs-17組的存活時間明顯長于對照組(P0.001)和 BMSCs 組(P0.01)。(2)移植物外觀及HE染色術(shù)后第12天移植皮膚的外觀:對照組約2/3的移植皮膚發(fā)黑壞死,部分結(jié)痂,BMSCs組移植皮膚大部分存活良好,僅少量出現(xiàn)發(fā)黑、壞死,BMSCs-17組移植皮膚成活良好,無發(fā)黑、壞死,甚至毛發(fā)正常生長。HE染色顯示,對照組有大量炎性細(xì)胞浸潤、脫落和無血管生成,BMSCs組有少量炎性細(xì)胞浸潤和血管生成,BMSCs-17組炎性細(xì)胞浸潤少,血管生成多。(3)BMSCs示蹤IL-17預(yù)處理后,更多的BMSCs定植于移植物,經(jīng)IL-17處理后BMSCs向植皮區(qū)歸巢的數(shù)量增加。(4)受體Treg亞群比例皮膚移植術(shù)后第7天,對照組Treg亞群比例明顯低于其他兩組(P0.001),BMSCs-17組Treg亞群比例明顯高于其他兩組(P0.001)。(5)受體血清中細(xì)胞因子含量:對照組TGF-β、IL-10明顯低于其他兩組(p0.001),BMSCs-17 組 TGF-β、IL-10 均顯著高于 BMSCs 組(p0.001);對照組 IFN-γ明顯高于 BMSCs 組和 BMSCs-17 組(p0.001),BMSCs-17 組 IFN-y明顯低于BMSCs組(p0.001)。結(jié)論1.BMSCs貼壁生長,具有多向分化的潛能,可以在特定的分化培養(yǎng)基中分化為成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞,并特異性表達(dá)相關(guān)表面抗原。2.通過脾淋巴細(xì)胞增殖抑制實驗說明IL-17顯著增強了BMSCs對淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用。3.IL-17通過增強BMSCs免疫抑制的作用以及其歸巢能力,來誘導(dǎo)受體免疫耐受,最終達(dá)到減輕移植后免疫排斥反應(yīng),延長移植組織或器官存活時間的結(jié)果。意義皮膚作為全身免疫原性最強的器官之一,如果能解決皮膚移植免疫耐受的問題或者延長異體移植皮膚的存活時間,那這種方法理論上也可以應(yīng)用到別的器官移植中,減輕甚至消除免疫排斥反應(yīng),達(dá)到穩(wěn)定的免疫耐受狀態(tài),這對于器官移植來說具有深遠(yuǎn)的意義。因此我們將“IL-17可以增強BMSCs的免疫抑制作用”的理論應(yīng)用到同種異體皮膚移植的模型中來探討IL-17是否能夠增強BMSCs免疫抑制作用而達(dá)到誘導(dǎo)免疫耐受,繼而延長移植皮膚的存活時間。不足之處本實驗對“IL-17增強BMSCs的免疫抑制作用”的更深層次的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步實驗探明,相信該機(jī)制對臨床采用IL-17聯(lián)合BMSCs治療自身免疫性疾病及器官移植排異等會有較好的治療價值,未來我們將持續(xù)對這些機(jī)制進(jìn)行研究。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R644
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
符號說明
前言
第一部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
    一、材料和方法
    二、結(jié)果
    三、小結(jié)
    四、討論
第二部分 白介素17對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制淋巴細(xì)胞增殖作用影響的體外實驗
    一、材料和方法
    二、結(jié)果
    三、小結(jié)
    四、討論
第三部分 白介素17干擾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)同種異體皮膚移植免疫耐受作用的實驗研究
    一、材料和方法
    二、結(jié)果
    三、小結(jié)
    四、討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
學(xué)位論文評閱及答辯表
外文論文一
外文論文二

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