目的:熱射病(heatstroke,HS)是一種危及生命的疾病,熱應(yīng)激時(shí)在各類(lèi)細(xì)胞因子和炎癥因子的共同作用下,內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell)早期即可被激活且功能受損,而損傷的內(nèi)皮細(xì)胞可進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致多器官功能衰竭的發(fā)生。丹參酮IIA磺酸鈉(TanshinoneIIA sulfonate,STS)在血管內(nèi)皮保護(hù)中具有許多作用。目前研究表明,STS能夠抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,并減輕高溫引起的大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。因此,探討STS治療對(duì)熱打擊的內(nèi)皮細(xì)胞的影響對(duì)于防治中暑及闡明高熱對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷機(jī)制具有重要的理論與實(shí)踐意義。綜上,本研究旨在闡釋丹參酮IIA磺酸鈉(TanshinoneIIA sulfonate,STS)治療對(duì)熱打擊內(nèi)皮細(xì)胞的影響以及細(xì)胞對(duì)STS治療的反應(yīng)機(jī)制。方法:1.CCK-8法檢測(cè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)細(xì)胞在42℃暴露不同時(shí)長(zhǎng)的細(xì)胞活性,Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熱誘導(dǎo)不同時(shí)長(zhǎng)對(duì)HUVEC細(xì)胞凋亡率的影響,Western-blotting檢測(cè)熱誘導(dǎo)后HUVEC細(xì)胞中凋亡相關(guān)分子變化,探討熱誘導(dǎo)對(duì)HUVEC細(xì)胞凋亡水平的影響。2.HUVEC細(xì)胞在STS不同濃度作用下細(xì)胞活性改變,及熱誘導(dǎo)后恢復(fù)不同的時(shí)長(zhǎng)HUVEC細(xì)胞的活性改變,以此篩選STS的作用濃度,和熱誘導(dǎo)后的恢復(fù)時(shí)間。3.CCK-8法檢測(cè)HUVEC細(xì)胞在STS作用下細(xì)胞活性的變化,Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)STS對(duì)熱誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞凋亡率的影響,利用caspase活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)凋亡效應(yīng)酶Caspase-3的活性。探討STS在熱誘導(dǎo)的環(huán)境中對(duì)HUVEC細(xì)胞的保護(hù)作用。4.探討STS對(duì)熱誘導(dǎo)引起HUVEC細(xì)胞凋亡影響的機(jī)制。硝酸鹽/亞硝酸鹽比色分析法檢測(cè)STS對(duì)熱誘導(dǎo)不同時(shí)長(zhǎng)HUVEC細(xì)胞中亞硝酸鹽產(chǎn)量的影響,western blot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)eNOS的磷酸化水平,利用eNOS的抑制劑L-NMMA阻斷eNOS的磷酸化,檢測(cè)STS對(duì)阻斷eNOS后HUVEC細(xì)胞中eNOS磷酸化的影響、STS對(duì)高溫引起的HUVEC細(xì)胞活性及細(xì)胞凋亡率的影響。初步探討NO與熱誘導(dǎo)引起的HUVEC細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。5.探討熱誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞中eNOS的磷酸化是否由Akt的磷酸化而調(diào)節(jié)。利用western blot檢測(cè)STS對(duì)熱誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)HUVEC細(xì)胞中Akt磷酸化情況的影響,STS對(duì)阻斷Akt磷酸化后HUVEC細(xì)胞中eNOS的影響,利用了Akt的抑制劑MK-2206后,利用western blot檢測(cè)STS對(duì)熱誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)HUVEC細(xì)胞中Akt磷酸化情況。6.探索STS誘導(dǎo)的Akt磷酸化或eNOS磷酸化是否通過(guò)PI3激酶依賴(lài)的調(diào)控機(jī)制所控制。利用PI3K抑制劑Wortmannin,western blot檢測(cè)高溫環(huán)境下STS引起的HUVEC細(xì)胞中磷酸化的Akt及磷酸化的eNOS的變化。抑制劑MK-2206、Wortmannin對(duì)熱誘導(dǎo)下HUVEC細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果:1.HUVEC細(xì)胞在42℃暴露不同時(shí)長(zhǎng)細(xì)胞活性隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低,熱誘導(dǎo)不同時(shí)長(zhǎng)HUVEC細(xì)胞凋亡率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增高,熱誘導(dǎo)后HUVEC細(xì)胞中cleaved-caspase-3隨時(shí)間延長(zhǎng)而蛋白表達(dá)水平增高。2.STS作用濃度為2μg/ml時(shí),熱誘導(dǎo)后的HUVEC細(xì)胞活性有明顯改善;在恢復(fù)2小時(shí)時(shí)STS的保護(hù)作用已顯現(xiàn);當(dāng)恢復(fù)時(shí)間越來(lái)越長(zhǎng),細(xì)胞在無(wú)藥物作用下活性也會(huì)有一定程度的回升,且即使STS作用濃度非常低(0.002μg/ml)也能有保護(hù)細(xì)胞的作用。3.在暴露于42℃中1小時(shí)后,可以觀察到在熱誘導(dǎo)后細(xì)胞有變圓和脫落的現(xiàn)象,而用STS(2μg/ml)處理后這種現(xiàn)象有了明顯的減輕。從細(xì)胞活性檢測(cè)的情況看,在暴露于42℃中1小時(shí)后,可以觀察到在熱誘導(dǎo)后細(xì)胞活性降低,而用STS(2μg/ml)處理后細(xì)胞活性有了一定程度的回升。在用STS(2μg/ml)處理后再將細(xì)胞暴露于42℃中1小時(shí),相對(duì)于STS未處理的熱誘導(dǎo)組細(xì)胞,STS處理后使熱誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞凋亡率明顯減少,結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。熱誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞在STS作用后,凋亡效應(yīng)酶Caspase-3的活性降低。探討STS在熱誘導(dǎo)的環(huán)境中對(duì)HUVEC細(xì)胞的保護(hù)作用。4.在沒(méi)有STS處理時(shí),熱誘導(dǎo)下HUVEC細(xì)胞的亞硝酸鹽生成量在0.5小時(shí)顯著增加,1和2小時(shí)急劇下降,亞硝酸鹽產(chǎn)量在2小時(shí)處于基線水平。而經(jīng)STS(2μg/ml)處理的HUVEC細(xì)胞,在熱誘導(dǎo)后細(xì)胞中亞硝酸鹽的生產(chǎn)逐漸增加,在1小時(shí)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),顯著高于同時(shí)期未用STS處理的HUVEC細(xì)胞中亞硝酸鹽的水平。HUVEC細(xì)胞中的eNOS蛋白磷酸化水平在熱誘導(dǎo)后15分鐘和30分鐘時(shí)有所增加,在1小時(shí)和2小時(shí)時(shí)eNOS的磷酸化又有所降低,經(jīng)過(guò)STS(2μg/ml)處理后,HUVEC細(xì)胞中eNOS磷酸化從熱誘導(dǎo)后15分鐘到1小時(shí)呈持續(xù)增加。在L-NMMA預(yù)處理后,即使有STS的作用,HUVEC細(xì)胞在熱誘導(dǎo)后,eNOS的磷酸化水平無(wú)明顯改變。此外,L-NMMA的預(yù)處理使高溫引起的HUVEC細(xì)胞活性減弱,在STS作用后情況并無(wú)改觀。同樣,L-NMMA的預(yù)處理使高溫引起的HUVEC細(xì)胞cleaved-caspase-3表達(dá)增多,STS作用對(duì)這個(gè)情況也無(wú)改觀。5.在沒(méi)有STS處理的情況下,和熱誘導(dǎo)1小時(shí)和2小時(shí)相比,在熱誘導(dǎo)15分鐘和30分鐘時(shí)HUVEC細(xì)胞中磷酸化Akt水平增高。然而,如果經(jīng)STS(2μg/ml)作用后,Akt磷酸化隨時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)增加,在1小時(shí)時(shí)趨于穩(wěn)定。MK-2206預(yù)處理后,熱誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞在MK-2206預(yù)處理后可以抑制STS誘導(dǎo)的eNOS磷酸化增強(qiáng),同樣,MK-2206預(yù)處理可顯著抑制STS對(duì)高溫下HUVEC細(xì)胞中亞硝酸鹽產(chǎn)量的影響。6.Wortmannin抑制了高溫環(huán)境下STS引起的HUVEC細(xì)胞中eNOS和Akt的磷酸化的增強(qiáng)。此外,Wortmannin的預(yù)處理也可以抑制STS引起的高溫時(shí)HUVEC細(xì)胞中增加亞硝酸鹽的含量。MK-2206預(yù)處理導(dǎo)致熱誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞凋亡比例的增加,這一情況無(wú)論是否加入STS都無(wú)法改變。MK-2206預(yù)處理導(dǎo)致熱誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞中裂解的caspase-3表達(dá)增高,這一情況同樣不受STS的影響。結(jié)論:1.熱應(yīng)激可誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞凋亡,隨著熱誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)凋亡率增加;2.適量的STS可以抑制熱應(yīng)激引起的HUVEC細(xì)胞凋亡;3.STS作用可以激活PI3K/Akt通路,使eNOS磷酸化增加,從而導(dǎo)致HUVEC在熱應(yīng)激狀態(tài)下一氧化氮(NO)產(chǎn)生增多。STS可以通過(guò)PI3K/AKT/eNOS途徑抑制熱應(yīng)激引起的HUVEC細(xì)胞凋亡。意義:本研究初步闡明了STS對(duì)熱誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞凋亡影響的相關(guān)作用機(jī)制,同時(shí)也反映出HUVEC細(xì)胞針對(duì)高熱做出的應(yīng)答反應(yīng),為探尋熱射病損傷內(nèi)皮細(xì)胞機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),也為輔助治療提供了潛在作用靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R594.12
【部分圖文】：

是由于與高熱引起的一些急性生理改變之間復(fù)雜的相互作用（例如，循環(huán)衰竭，??缺氧和代謝需求增加）而產(chǎn)生的，熱的直接細(xì)胞毒作用，與宿主炎癥和凝血反應(yīng)。??這一系列事件導(dǎo)致微循環(huán)血流改變，導(dǎo)致血管內(nèi)皮和組織損傷（如圖１－１所示）。??５??

參酮ＩＩＡ磺酸鈉預(yù)防血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究結(jié)?果??測(cè)熱誘導(dǎo)不同時(shí)長(zhǎng)ＨＵＶＥＣ細(xì)胞的相對(duì)ＨＵＶＥＣ細(xì)胞活性產(chǎn)生的影響，我們用ＣＣＫ－８活露不同時(shí)間的ＨＵＶＥＣ細(xì)胞活性。ＨＵＶＥＣ細(xì)胞在４、０．５小時(shí)、１小時(shí)、１．５小時(shí)、２小時(shí)、２．５小時(shí)、３檢測(cè)細(xì)胞活性隨著時(shí)間的延遲而減少（圖２－１）。??－

２－２－１ＨＵＶＥＣ、（Ｃ）、（Ｄ）分別表示熱誘導(dǎo)０小時(shí)、１小時(shí)、２小時(shí)、４小時(shí)后Ａｎｎｅｘｉｎ?ＨＵＶＥＣ細(xì)胞的凋亡率。??１００－１??ｇ?一??ｗ?８０－?丁??ａ?？??＞?６０－??Ｉ?丁??＾?４０－?？??０?－Ｉ—??〇?２０．??Ｓ：??〇－＊—Ｉ?．?．??＾?＾?＾??Ｈｅａｔ?Ｔｒｅａｔｅｄ?Ｔｉｍｅ??圖２－２－１熱誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)ＨＵＶＥＣ細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2850112