研究目的： (1)觀察血必凈注射液對(duì)內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide, LPS)刺激下巨噬細(xì)胞增殖及吞噬功能的影響。 (2)觀察血必凈注射液對(duì)膿毒癥巨噬細(xì)胞分化的影響,并探索其發(fā)揮作用可能的信號(hào)通路。 研究方法： (1)分離提純小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后,以1×106/ml密度種板。生長(zhǎng)2h后,加入血必凈注射液(Omg/ml,1mg/ml,5mg/ml,10mg/ml,50mg/ml,100mg/ml)孵育1h,再加入LPS (100ng/ml)刺激： 分別于12h,24h,48h加入細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)試劑,孵育2h后,酶標(biāo)儀檢測(cè)450nnm處的吸光值(OD450nm); 孵育24h后,更換混有熒光微球的培養(yǎng)基(1：100),培養(yǎng)2h后,磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Solution, PBS)清洗未被吞噬的熒光微球,免疫熒光顯微鏡觀察照相或用胰酶消化后上流式直接檢測(cè)。 (2)分離提純小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后,以1×106/ml密度種板,生長(zhǎng)2h后,加入血必凈注射液(Omg/ml,1mg/ml，5mg/ml,10mg/ml,50mg/ml,100mg/ml)孵育1h,再加入LPS (100ng/ml)刺激： 分別在6h,12h,24h收集上清,酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)檢測(cè)腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF)-α,白介素(Interleukin, IL)-6, IL-10;收集細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)F4/80+CD11c+CD206-及F4/80+CD11c-CD206+細(xì)胞比例； 分別在0h,0.5h,2h,6h,24h固定細(xì)胞,使用活細(xì)胞ELISA方法檢測(cè)Janus激酶(Janus Kinase)1-信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal Transducers and Activators of Transcription, STAT)6總量及其磷酸化的比例。 (3)分離提純小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后,以1×106/ml密度種板,分別給予JAK1及STAT6抑制劑干預(yù)2h后,再加入血必凈注射液(5mg/ml)培養(yǎng)1h,而后給予LPS (100ng/ml)刺激,24h后收集上清ELISA法檢測(cè)TNF-α,IL-6, IL-10;收集細(xì)胞流式檢測(cè)F4/80+CD100c+CD206-及F4/80+CD100c-CD206+細(xì)胞比例。 (4)制備小鼠盲腸結(jié)扎穿孔(Cecal Ligation and Puncture, CLP)模型,實(shí)驗(yàn)組給予血必凈注射液,對(duì)照組給予PBS,分別于術(shù)后0.5h,12h,24h,36h,48h,60h,72h,84h,96h進(jìn)行肌肉注射： 術(shù)后12h,24h,48h,60h,72h,84h,96h,120h計(jì)數(shù)存活小鼠,Kaplan-Merer法進(jìn)行生存率分析； 術(shù)后6h,24h,48h處死小鼠留取外周血血清檢測(cè)]TNF-α, IL-6,IL-10;灌洗腹腔巨噬細(xì)胞流式檢測(cè)F4/80+CD11c+CD206-及F4/80+CD11c-CD206+細(xì)胞比例。 結(jié)果： (1)在一定劑量(5mg/ml)的血必凈注射液干預(yù)下,LPS刺激下巨噬細(xì)胞增殖明顯,而高于10mg/ml的劑量則會(huì)產(chǎn)生明顯的抑制作用,在時(shí)間上則以48h時(shí)間點(diǎn)最為顯著；在5mg/ml及10mg/ml劑量的血必凈注射液干預(yù)下,LPS刺激后巨噬細(xì)胞的吞噬功能增強(qiáng),而在50mg/ml和100mg/ml劑量下則產(chǎn)生抑制作用。 (2)在中等劑量(5mg/ml)的血必凈注射液干預(yù)下,LPS刺激后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞由M1型向M2型分化,且以刺激24h最為明顯；當(dāng)劑量高于10mg/ml時(shí),這種促進(jìn)作用減弱。 (3)中等劑量(5mg/ml)的血必凈注射液在2h時(shí)間點(diǎn)下,JAK1-STAT6磷酸化增強(qiáng)；給予JAK1以及STAT6特異性抑制劑后,促M(fèi)2型分化的效應(yīng)減弱。 (4)血必凈注射液干預(yù)組小鼠外周血血清M1型相關(guān)細(xì)胞因子(TNF-α、 IL-6)較對(duì)照組明顯降低,而M2相關(guān)的細(xì)胞因子(IL-10)較對(duì)照組升高；灌洗小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中M2型巨噬細(xì)胞比例增加；小鼠生存率提高。 結(jié)論： (1)中等劑量(5mg/ml)的血必凈注射液可以促進(jìn)LPS刺激下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的增殖,并增強(qiáng)其吞噬功能；而在高于10mg/ml的劑量下則會(huì)產(chǎn)生抑制作用。 (2)中等劑量(5mg/ml)的血必凈注射液可以促進(jìn)LPS刺激下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞由M1向M2分化,而在高于10mg/ml劑量下這種促進(jìn)作用減弱；其作用的分子機(jī)制與JAK1-STAT6通路有關(guān)。 (3)血必凈注射液可以提高膿毒癥小鼠的生存率,且與其促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞的分化有關(guān)。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R459.7
【部分圖文】：

10 50 100 mg/mi圖1-1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同劑量下血必凈注射液對(duì)小鼠腹腔巨嗟細(xì)胞吞噴功能的影響XBJ Omg/ml XBJ 1mg/m丨 XBJ 5mg/ml盡盡盡■ ■■XBJ 10mg/ml XBJ 50mg/m丨 XBJ 100mg/ml圖1-2免疫焚光顯微鏡觀察不同劑量下血必凈注射液對(duì)小鼠腹腔巨隨細(xì)胞吞嗟功能的影響1.3討論當(dāng)機(jī)體遭受外界病原入侵時(shí)，組織原位巨唾細(xì)胞（local macrophages)首當(dāng)其沖，它通過識(shí)別、吞唾、抗原提呈等作用殺滅病原菌，釋放趨化因子（CXCL9、7
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 姚詠明,盛志勇;膿毒癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的現(xiàn)代認(rèn)識(shí)[J];中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué);2003年01期

本文編號(hào)：2839140