PAR1在內(nèi)皮細胞凋亡及程序性壞死介導重癥中暑急性肺損傷中的作用研究

發(fā)布時間：2020-08-22 18:38

【摘要】：研究背景和目的:重癥中暑(Heatstroke)是危及人類生命的熱相關性疾病,常合并多臟器功能不全。肺損傷是早期高發(fā)的并發(fā)癥之一,主要表現(xiàn)為肺水腫、肺出血及呼吸衰竭。熱打擊可引起肺微血管內(nèi)皮細胞(PMVECs)凋亡及程序性壞死,其是介導肺損傷的重要機制。蛋白酶激活受體1(Protease-activated receptor1,PAR1)是一種G蛋白偶聯(lián)跨膜受體,是凝血酶激活進而導致炎癥反應的主要受體。有研究顯示,熱打擊后內(nèi)皮細胞PAR1顯著增加,引起血管內(nèi)皮細胞通透性升高,從而導致小鼠肺損傷的發(fā)生,但其具體機制尚不明確。本研究選用C57BL/6小鼠及PMVECs,研究PAR1與下游信號NF-κB/c-Jun在熱打擊介導細胞凋亡中的作用及PAR1與下游RIP1/RIP3及MLKL/HMGB1在程序性壞死中的作用。主要方法和結(jié)果:1.建立重癥中暑小鼠模型,成年雄性C57BL/6小鼠置于39℃、65%濕度的高溫倉內(nèi),核心體溫(Tc)達到42.7℃造模成功,分室溫正常對照組(NC);重癥中暑組(HS);PAR1抗體預處理中暑組(anti-PAR1);PAR1抑制劑RWJ56110預處理重癥中暑組(RWJ+HS)。與HS組比較,使用RWJ56110及PAR1抗體腹腔注射預處理小鼠可明顯改善小鼠熱耐受力。給予PAR1抑制劑RWJ56110預處理可明顯延長重癥中暑小鼠生存時間,改善生存率;可降低重癥中暑小鼠血清中TNF-α、IL-6及HMGB1水平,減輕全身炎癥反應,同時可降低肺泡灌洗液中白細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)、蛋白含量、肺水及干濕重比,從而改善肺損傷。2.PMVECs給予43℃熱打擊90 min(中度熱打擊),在恢復溫度各時間點(0,2,6,12 h),Hoechst33342染色后,用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況、Western blotting 檢測 Mcl-1、Bax、PAR1 及 c-Jun 表達水平,ELISA 檢測 Caspase-3及NF-κB活性,流式細胞儀分析細胞凋亡。結(jié)果示隨復溫時間延長,PMVECs細胞凋亡數(shù)目明顯增加,Mcl-1、Bax、c-Jun、p-c-Jun表達水平、Caspase-3活性明顯增加。給予PAR1 siRNA敲除PAR1及腺病毒過表達PAR1(Ad-PAR1)預處理細胞后,給予相同條件熱打擊,復溫12 h檢測相關蛋白表達及細胞凋亡情況,經(jīng)Ad-PAR1及PAR1激動劑TFLLR-NH2預處理的細胞,Mcl-1明顯降低、Bax的表達及Caspase-3活性顯著增加,凋亡數(shù)目增加;PAR1 siRNA及PAR1抑制劑SCH79797預處理的細胞,Mcl-1明顯增加、Bax的表達及Caspase-3活性顯著下降,凋亡數(shù)目減少,同時還可使NF-κB DNA結(jié)合力增強,p-c-Jun和c-Jun的蛋白表達水平顯著下降;使用c-Jun siRNA轉(zhuǎn)染細胞,于熱打擊后復溫12 h檢測細胞凋亡情況,敲除c-Jun后,細胞凋亡顯著減少,c-Jun活化在熱打擊的PMVECs起著促凋亡作用,我們前期研究結(jié)果表明NF-κB活化在熱打擊的PMVECs中起抗凋亡作用,綜上所述,PAR1通過抑制NF-κB活化及增強c-Jun活化起著促凋亡作用。3.建立重癥中暑小鼠模型,復溫2 h,ELISA方法檢測肺泡灌洗液中HMGB1及RIP3水平。與對照組比較,給予PAR1抑制劑RWJ56110處理的小鼠,肺泡灌洗液中HMGB1及RIP3水平降低;肺組織中RIP1/RIP3復合物的形成減少。PMVECs給予43℃熱打擊3 h(重度熱打擊),恢復期各個時間點(0,2,6,12 h)檢測到RIP1及MLKL蛋白表達水平顯著升高;恢復期6 h,壞死小體(RIP1/RIP3 復合物)形成;RIP1 抑制劑 Nec-1、RIP1siRNA、RIP3siRNA 及兩者聯(lián)合預處理可抑制PMVECs發(fā)生程序性壞死;給予PAR1抑制劑預處理,減輕熱打擊導致的HMGB1移位,減少細胞程序性壞死。結(jié)論PAR1可能通過抑制NF-κB活化及激活c-Jun促進熱打擊PMVECs凋亡,并通過促進RIP1/RIP3復合物形成導致PMVECs程序性壞死,從而引起重癥中暑急性肺損傷。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R594.12;R563
【圖文】：

程序性,炎癥性腸病,缺血再灌注損傷,動脈粥樣硬化

圖１－２程序性壞死細胞信號通路圖逡逑ＦＩＧ．邋１－２邋Ｓｉｇｎａｌ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｏｆ邋ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ邋ｃｅｌｌｓ．逡逑程序性壞死在心肌梗死、動脈粥樣硬化，缺血再灌注損傷和炎癥性腸病中起逡逑重要的病理生理作用。近年來研究報道，程序性壞死在包括慢性阻塞性肺病逡逑（ＣＯＰＤ）、肺癌、急性肺損傷、感染和膿毒癥的發(fā)病機制中起重要作用［６９］。目逡逑前，壞死性凋亡被定義為ＲＩＰ３依賴性壞死性細胞死亡，將ＲＩＰＫ３敲除可完全緩逡逑

小鼠,生存率,預處理

逡逑條件下飼養(yǎng)，計算７２邋ｈ生存率。由圖２－７所示，經(jīng)ＲＷＪ５６１１０預處理的小鼠重癥逡逑中暑后死亡率明顯下降。逡逑１５０ｎ逡逑ＨＳ逡逑－邐ＨＳ＋ＲＷＪ逡逑！邋１０0１逡逑的邐１逡逑０邐１邐１逡逑ｅ邋５0－邋ｈ逡逑１邐１邐■逡逑０邐１０００邐２０００邐３０００邐４０００邐５０００逡逑Ｔｉｍｅ逡逑圖２－２邋ＲＷＪ５６１１０預處理對重癥中暑小鼠生存率的影響。ＨＳ＋ＲＷＪ為重癥中暑前給ＲＷＪ５６１１０逡逑組，ＨＳ為重癥中暑組。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ２－２．邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＲＷＪ５６１１０邋ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋ｏｎ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ邋ｒａｔｅ邋ｏｆ邋ｓｅｖｅｒｅ邋ｈｅａｔｓｔｒｏｋｅ邋ｍｉｃｅ．逡逑ＨＳ＋ＲＷＪ邋ｗａｓ邋ｇｉｖｅｎ邋ＲＷＪ５６１１０邋ｇｒｏｕｐ邋ｂｅｆｏｒｅ邋ｓｅｖｅｒｅ邋ｈｅａｔ邋ｓｔｒｏｋｅ．邋ＨＳ邋ｉｓ邋ｓｅｖｅｒｅ邋ｈｅａｔ邋ｓｔｒｏｋｅ邋ｇｒｏｕｐ逡逑１．５邋ＲＷＪ５６１１０預處理可降低重癥中暑小鼠血清中ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－６及逡逑ＨＭＧＢ１水平。逡逑建立重癥中暑動物模型，重癥中暑組小鼠分為對照中暑組（ＨＳ），及給予腹逡逑腔注射ＲＷＪ５６１１０預處理的中暑組（ＲＷＪ＋ＨＳ），達到重癥中暑條件后置于室溫逡逑條件下飼養(yǎng)，于恢復期不同時間點處于小鼠心臟采血，檢測ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－６及逡逑ＨＭＧＢ１水平，如圖２－３所示，小鼠發(fā)生重癥中暑后ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－６及ＨＭＧＢ１水逡逑平Ｏｈ即發(fā)生明顯升高，２邋ｈ達到高峰，后逐漸恢復到較低水平，但仍較基礎水逡逑平升高，小鼠經(jīng)ＲＷＪ５６１１０預處理后ＴＮＦ－ｏｕ邋ＩＬ－６及ＨＭＧＢ１水平較ＨＳ均存在逡逑不同程度的降低

小鼠,預處理,生存率,重癥