發(fā)布時(shí)間：2020-08-19 13:19

【摘要】：目的鎂黃長(zhǎng)石在皮膚組織工程的應(yīng)用是個(gè)全新的方向,目前少數(shù)報(bào)道可見其在創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域中能起到抗炎、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分化的作用,但創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜而精密的過(guò)程,尤其是在再上皮化及重塑階段,鎂黃長(zhǎng)石促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制尚未闡明。本試驗(yàn)旨在觀察鎂黃長(zhǎng)石對(duì)表皮干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖、遷移的作用,深入探究生物活性陶瓷—鎂黃長(zhǎng)石提供的多種陽(yáng)離子啟動(dòng)與創(chuàng)面愈合相關(guān)的信號(hào)通路,為鎂黃長(zhǎng)石在組織工程學(xué)的應(yīng)用上提供一個(gè)新方向和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1.選用人表皮干細(xì)胞(Human epidermal stem cells,hESCs)系進(jìn)行體外試驗(yàn)。使用生物活性陶瓷—鎂黃長(zhǎng)石(Akermanite,Aker)制成浸提液,稀釋成為不同濃度,將hESCs放置于中,用CCK-8法篩選出培養(yǎng)hESCs最適宜的浸提液濃度,進(jìn)一步用免疫熒光(Immunofluorescence,IF)及流式細(xì)胞術(shù)(Flow CytoMetry,FCM)定量檢測(cè)三個(gè)細(xì)胞亞群(G0/G1、S和G2/M)的分布來(lái)判定細(xì)胞增殖情況;然后用RT-q-PCR法及western blot法檢測(cè)出hESCs“干性”相關(guān)分子Itgβ1、lgr4、lgr5和lgr6等的基因表達(dá),進(jìn)一步探究浸提液刺激hESCs干性及增殖能力變化的可能機(jī)制。另外,通過(guò)S cratch法觀察浸提液對(duì)hESCs的移行能力的影響,采用RT-q-PCR法及western blot法探究與遷移相關(guān)的整合素亞基的基因及蛋白的表達(dá)。2.提取及培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞(Human Fibroblasts)進(jìn)行體外試驗(yàn)。使用鎂黃長(zhǎng)石制成浸提液,用CCK-8法篩選出培養(yǎng)hESCs的最佳濃度,進(jìn)一步用FCM法測(cè)Aker對(duì)成纖維細(xì)胞增殖能力的作用;然后采用RT-q-PCR法及western blot法,測(cè)出成纖維細(xì)胞在Aker處理后,合成出的新的Ⅰ、Ⅲ型膠原的基因、蛋白之表達(dá);另外,通過(guò)Scratch法觀察Aker對(duì)成纖維細(xì)胞遷移能力的作用,采用RT-q-PCR法及western blot法探究與遷移能力相關(guān)的整合素亞基的基因及蛋白的表達(dá)。3.建立BALB/c小鼠燙傷模型,給予Aker粉劑治療和不治療處理。觀察兩組的創(chuàng)面愈合情況。用造模后3、7、14和21天皮膚創(chuàng)面組織,通過(guò)HE、IF和Masson染色方法,觀察和統(tǒng)計(jì)再上皮化、表皮厚度、hESCs干性及膠原沉積的情況。結(jié)果1.Aker浸提液對(duì)hESCs增殖起到了促進(jìn)誘導(dǎo)作用,并在不同稀釋比例的溶液中其作用表現(xiàn)強(qiáng)弱不同。結(jié)果示1/16濃度,其提升細(xì)胞活力的作用最為顯著。1/16濃度浸提液培養(yǎng)的 hESCs,RT-q-PCR 及 western blot 定量檢測(cè),其 Itgβ1、lgr4、lgr5 和 lgr6的mRNA表達(dá)上調(diào),Itgβ1蛋白也有提高,提示浸提液增加了 hESCs的干性,致使它的增殖能力變強(qiáng)。同時(shí)RT-q-PCR及western blot定量測(cè)出Wnt/β-catenin信號(hào)通路上有代表性的β-catenin、c-myc、ccnd1的mRNA和蛋白表達(dá)都有上調(diào),顯示該信號(hào)通路被Aker含的活性陽(yáng)離子激活。另外,劃痕法顯示1/16濃度組相較于陰性對(duì)照組hESCs的遷移能力大大的提高,RT-q-PCR及western blot定量檢測(cè)結(jié)果提示浸提液促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)的整合素α5β1、α3β1和α6β4上調(diào)。2.Aker浸提液也促進(jìn)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖,并在不同稀釋比例的溶液中的作用表現(xiàn)強(qiáng)弱不同。此時(shí)1/64濃度,其在提高細(xì)胞活力和增殖能力最為顯著。1/64濃度浸提液處理的成纖維細(xì)胞,用RT-q-PCR、western blot定量分析,顯示其Ⅰ、Ⅲ型膠原的mRNA及蛋白表達(dá)均有提高。另外,劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1/64濃度組相較于陰性對(duì)照,成纖維細(xì)胞遷移能力增強(qiáng),RT-q-PCR及western blot定量檢測(cè)結(jié)果提示Aker促進(jìn)此種細(xì)胞的整合素α5β1和α3β1上調(diào)。3.小鼠燙傷模型實(shí)驗(yàn),證實(shí)Aker粉劑帶來(lái)促皮膚愈合的效應(yīng)。HE染色結(jié)果顯示,Aker粉劑組的再上皮化進(jìn)程加速,上皮厚度在愈合中期明顯厚于對(duì)照組,提示Aker粉劑可以有效加強(qiáng)表皮細(xì)胞的增殖與分化。IF染色結(jié)果顯示,在皮膚切片整合素β1表達(dá)上,Aker粉劑組要強(qiáng)于對(duì)照組,提示該種活性陶瓷可提高表皮細(xì)胞的干性。同時(shí),Masson染色的皮膚切片顯示,經(jīng)Aker處理的創(chuàng)面,膠原沉積面積相較要大,排列要整齊,提示鎂黃長(zhǎng)石對(duì)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分泌合成膠原,修復(fù)效果要好。結(jié)論本研究對(duì)生物活性陶瓷--鎂黃長(zhǎng)石促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合的機(jī)制進(jìn)行了初步探索,發(fā)現(xiàn)Aker浸提液里包含的鈣鎂硅三種陽(yáng)離子能夠激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,提高表皮細(xì)胞的干性,起到促進(jìn)表皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的增殖及遷移的作用,從而加速的再上皮化和膠原的沉積,實(shí)現(xiàn)縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間,擴(kuò)展了生物活性陶瓷在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用范圍,為創(chuàng)面愈合臨床治療提供新的思路、方向和理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R641
【圖文】：

速度明顯提高，與陰性對(duì)照組呈現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而其他三個(gè)Ａｋｅｉ？組與對(duì)照組無(wú)明逡逑顯差異，第６天時(shí)，除１／４濃度Ａｋｅｒ組增殖速度仍最低于陰性對(duì)照組外，其他三個(gè)逡逑Ａｋｅｒ組皆強(qiáng)于陰性對(duì)照組（圖１－１）。說(shuō)明，１／１６濃度Ａｋｅｒ組可以顯著提高細(xì)胞的增殖逡逑活性。逡逑３．０－，邐丨二１逡逑＾邐＼邋－，１邐ＥＨ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑Ｅ邋２．５－邐ｉ邋．知W邋１／４逡逑ｉ邋２．0－邐。邐白二逡逑１１－５＿邐“邐Ａ邋１／２５６逡逑５邋１．０－邐Ｓｉｉｔｅ逡逑Ｓ邋＾邋＾邋：邋�。剑儒澹海欤剑湾义希埃癲剩ⅲ海哄義希卞危插危沖危村危靛危跺澹ǎ模幔╁義賢跡保備髖ǘ齲粒耄澹蚪嵋杭岸哉張嘌裕牛櫻茫蠡钚緣撓跋歟停穡跡埃埃擔(dān)穡跡埃埃埃卞義希玻板義

本文編號(hào)：2797136