【摘要】：背景 腦損傷(Traumatic brain injury, TBI)是導(dǎo)致人口高死亡率和高致殘率的主要原因之一。TBI后引起炎癥聯(lián)鎖反應(yīng)導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷,其中炎癥反應(yīng)被認為是關(guān)鍵因素之一。TBI后腦組織細胞釋放多種促炎因子和抗炎因子,介導(dǎo)炎癥聯(lián)鎖反應(yīng)的激活。TBI導(dǎo)致的強烈的炎癥反應(yīng)特點是：血腦屏障破壞后,外周白細胞浸潤進入腦實質(zhì)以及內(nèi)源性免疫細胞的激活。外周浸入到腦組織的的中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞等直接影響神經(jīng)系細胞的存活和死亡。此外,腦組織內(nèi)活化的小膠質(zhì)細胞遷移到損傷部位,并釋放細胞因子、趨化細胞因子、活性氧、一氧化氮、蛋白酶和其他具有細胞毒性作用物質(zhì),繼而可能加重神經(jīng)元死亡。 然而,這些免疫細胞和炎癥介質(zhì)也可以在TBI病理過程中起到神經(jīng)保護作用。比如,T淋巴細胞在TBI的后期可能起到促進神經(jīng)修復(fù)的作用。促炎因子IL-1、IL-6和TNF-a在對神經(jīng)細胞的影響作用上都是具有雙重作用,既有有害的一面也有有利的一面。另外,小膠質(zhì)細胞在腦組織中能清除壞死的細胞碎片、促進腦神經(jīng)細胞的重塑以及在某些特定的條件下發(fā)揮神經(jīng)保護的作用�？傊�,TBI導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)是繼發(fā)性腦損傷中關(guān)鍵因素,這就表明我們可以通過抗炎或者免疫調(diào)節(jié)的治療手段可能對TBI導(dǎo)致的一系列病理過程起到有效的治療或保護作用。 以往的研究表明,間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system, CNS)損傷,包括TBI、中風(fēng)和脊髓損傷(Spinal cord injury, SCI)的動物模型中發(fā)揮有益作用。這些研究的主要結(jié)果表明：干細胞促進神經(jīng)功能的恢復(fù),減少細胞凋亡,增加內(nèi)源性細胞增殖,促進血管生成,減少病灶大小。移植的MSCs在CNS損傷中發(fā)揮有益作用的可能機制包括：MSCs具有遷移到損傷灶的能力；能分化成神經(jīng)細胞,以取代受損的神經(jīng)細胞；以及MSCs分泌的各種的生長因子發(fā)揮作用。然而,最近的證據(jù)表明,MSCs移植的治療效果可能不是通過直接的細胞替代作用,而是通過調(diào)節(jié)宿主微環(huán)境發(fā)揮作用。MSCs可分泌多種生物活性分子,比如各種營養(yǎng)因子及多種抗凋亡分子,這些物質(zhì)可能是發(fā)揮治療作用的主要機制。 最近研究表明,MSCs具有免疫調(diào)節(jié)特性。MSCs可以直接抑制T淋巴細胞和小膠質(zhì)細胞的增殖,并且可以影響樹突狀細胞和單核細胞和／或巨噬細胞分泌炎癥因子。另外,MSCs還可以抑制中性粒細胞產(chǎn)生的活性氧化物質(zhì)fMLP(甲�；�-甲硫氨基-亮氨酰基-苯丙氨酸)的活性。在實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)模型中,移植的MSCs能抑制髓鞘特異的T細胞并且誘導(dǎo)外周免疫耐受。移植的MSCs的免疫抑制效應(yīng)也被證明在急性、嚴重的移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease, GVHD)和多系統(tǒng)萎縮(Multiple system atrophy,MSA)有效。此外,MSCs還可誘導(dǎo)外周耐受并且遷移到到受傷的組織,抑制促炎癥細胞因子的釋放,促進受損細胞的生存。這些作用在急性肺損傷、心肌梗死、急性腎功能衰竭、腦缺血及阿爾茨海默氏病中已經(jīng)獲得證實。一些研究還發(fā)現(xiàn),其他干細胞也具有炎癥調(diào)節(jié)功能。其中有一項研究證實,移植的人臍帶血干細胞在大鼠中風(fēng)模型中具有抗炎作用；另有一項研究報告,在中風(fēng)超急性期通過靜脈注射神經(jīng)干細胞(Neural stem cells, NSCs), NSCs可通過與外周炎癥系統(tǒng)相互作用調(diào)節(jié)腦內(nèi)炎癥反應(yīng)。 這些研究提示,通過移植MSCs來減少腦組織炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)TBI后的免疫反應(yīng)具有可行性。然而,很少有研究同時關(guān)注MSCs對炎癥相關(guān)的細胞因子和免疫細胞在CNS損傷的作用,尤其是在TBI模型中的這種研究更鮮有報道。因此,在本研究中,我們使用SD大鼠的TBI動物模型,通過靜脈系統(tǒng)移植MSCs,探索MSCs在體內(nèi)對TBI誘導(dǎo)的抗炎反應(yīng)的抗炎作用及免疫調(diào)節(jié)性的特性,為深入理解MSCs移植治療TBI機制提供實驗基礎(chǔ)。 第一章大鼠骨髓MSCs的體外分離、培養(yǎng)與鑒定 目的 建立分離和培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs的方法。 方法 從SD大鼠骨髓中生提取、分離、培養(yǎng)MSCs。當細胞生長達到80-90%融合時,用胰蛋白酶消化貼壁細胞,進行傳代、擴增。擴增的第3-8代MSCs用于進一步的檢測或移植。使用流式細胞儀對MSCs的表型包括：CD44、CD90和CD105,以及造血干細胞標志物CD14、CD34、CD45和HLA-DR進行鑒定。 結(jié)果 流式細胞儀檢測的第3代MSCs結(jié)果為,表型CD44(99.01%)、CD90(99.28%)及CD105(97.71%)高表達；造血干細胞表型CD14(0.79%)、CD34(0.78%)、CD45(0.67%)及HLA-DR (1.11%)低表達。結(jié)論 通過本研究,我們在體外成功建立了分離、培養(yǎng)MSCs的可靠方法。MSCs具有較強的體外擴增能力,細胞表型符合國際MSCs的標準,可作為干細胞移植治療的理想種子。 第二章創(chuàng)傷性腦損傷腦皮層中炎癥相關(guān)免疫細胞和炎癥因子的時間變化研究目的 創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)可誘導(dǎo)強烈的炎癥反應(yīng),其可以持續(xù)數(shù)天至數(shù)月、導(dǎo)致嚴重的繼發(fā)性腦損傷。然而,尚鮮見炎癥相關(guān)免疫細胞與細胞因子在腦損傷過程中的動態(tài)關(guān)聯(lián)變化情況,尤其少見TBI后炎癥變化過程中其連續(xù)動態(tài)變化研究。方法 本研究中,我們使用SD大鼠腦沖擊傷的實驗動物TBI模型,采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測炎癥相關(guān)的細胞(中性粒細胞、T淋巴細胞、星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞)在腦組織內(nèi)的聚集變化情況,同時應(yīng)用multiplex assays檢測系統(tǒng),同步檢測炎癥相關(guān)的細胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、 IL-17、TNF-a、IFN-γ、RANTES、MCP-1、MIP-2和TGF-β1)在TBI后連續(xù)4周的變化情況。結(jié)果 TBI后第7天,小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的數(shù)量達到高峰。MPO+中性粒細胞和CD3+淋巴細胞分別在TBI后第1天和第3天達到高峰。細胞因子IL-1a, TNF-a、IL-17、IL-10和TGF-β1均在TBI后第1天和3天增加,接著開始逐漸下降,到第28天又開始出現(xiàn)增加的趨勢。趨化因子MCP-1、MIP-2和RANTES在TBI后第1天開始增加,隨后逐漸下降,直到第28天達到最低值。IL-1β從TBI后第1天開始增加,第3天達到高峰,之后逐漸下降。IL-6在TBI后第7天才開始增加,在第28天達到高峰。IFN-y在TBI后第14天到第28天才開始增高,并在第21天時達到高峰。IL-4從TBI后第14天才開始出現(xiàn)顯著增加,持續(xù)到第28天仍處于增高水平。 結(jié)論 炎癥相關(guān)細胞(星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞、中性粒細胞及淋巴細胞)及其分泌的細胞因子(IL-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-a、 IFN-γ、RANTES、MCP-1、MIP-2和TGF-β1)隨著TBI時間的延長,出現(xiàn)不同的時間變化規(guī)律。 第三章骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療腦損傷的免疫調(diào)節(jié)機制研究 目的 有很多研究表明MSCs移植治療腦損傷有效,其機制可能是通過MSCs轉(zhuǎn)分化作用或營養(yǎng)因子分泌作用,但很少有研究者關(guān)注MSCs對炎癥相關(guān)的細胞因子和免疫細胞在CNS損傷中的調(diào)節(jié)作用,尤其TBI模型中的該類研究。在本課題中,我們選用SD大鼠的TBI動物模型,通過靜脈系統(tǒng)移植MSCs,研究MSCs在體內(nèi)對TBI誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的抗炎作用及免疫調(diào)節(jié)性的特性。 方法 大鼠TBI后2小時,通過靜脈移植MSCs。采用mNSS評分系統(tǒng),評估TBI后第1、3、7、14、21和28天大鼠的神經(jīng)運動功能情況。TBI后72小時,我們通過免疫組織化學(xué)技術(shù)來確定GFAP+星形膠質(zhì)細胞、Iba-1+小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞、MPO+嗜中性粒細胞和CD3+淋巴細胞的密度。應(yīng)用multiplex assays檢測系統(tǒng),同步檢測腦皮層勻漿液中炎癥相關(guān)的細胞因子(IL-1a、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-a、IFN-γ、RANTES、MCP-1、MIP-2和TGF-β1)的濃度。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)和免疫印跡技術(shù)分別檢測免疫抑制相關(guān)因素抗炎因子TSG-6和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達含量。 結(jié)果 MSCs治療組rmNSS分數(shù)從TBI后第3至28天相對于PBS治療組明顯下降。兩組之間僅在TBI后24小時無顯著差異。PBS治療對照組和假手術(shù)組比較,PBS治療對照組腦組織含水量明顯升高；MSCs治療組和PBS治療對照組比較,MSCs治療后顯著降低腦組織含水量。MSCs治療TBI后,受損的腦實質(zhì)中小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞的激活有所減少,同時降低了腦組織損傷部位外周血白細胞浸潤的數(shù)量,以及減少了部分促炎性細胞因子,同時增加了一些抗炎細胞因子的表達。此外MSCs能增強TSG-6的表達,并能抑制活化的NF-κB信號傳導(dǎo)途徑。 結(jié)論 TBI引起的炎癥反應(yīng)中,MSCs具有調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)的細胞因子(IL-1p、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-a、IFN-γ、RANTES、MCP-1、MIP-2和TGF-β1)的釋放及調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)免疫細胞(小膠質(zhì)細胞、中性粒細胞及淋巴細胞)功能活性的能力。這一現(xiàn)象可能是通過MSCs增強TSG-6的表達、進一步抑制活化的NF-κB信號傳導(dǎo)途徑,從而降低促炎細胞因子而實現(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R651.15
【圖文】：
圖1-1不同代MSCs細胞學(xué)形態(tài)A：原代 MSCs; B：第 1 代 MSCs; C：第 3 代 MSCs; D：第 7 代 MSCs。標尺=50|imoFig. 1-1 The Different generations of MSCs cytology..A： POMSCs. B： PI MSCs； C： P3 MSCs； D： P7 MSCs. Bar = 50 fim.
博士學(xué)位論文 后Iba-1陽性小膠質(zhì)細胞/巨枿細胞開始逐漸增加，第7天達到高峰（尸<0.05) (C)。標尺*P<0.05，**P<0.01。Fig. 2-1 Time course of the changes in microglia/macrophage activation in the cortexafter TBI.Diagram of a coronal rat brain section showed the relationship between the focal lesions(red) and photographed regions (blue squares) (A). Iba-1 positive microglia/macrophagesdemonstrated the classical ramified morphology from day 1-28 after TBI (B). The number ofIba-1 positive microglia/macrophages was increased in comparison to the sham-operated group(p < 0.05)，and peaked at the 7^^^ day after TBI (C). Bar = 50 尸 < 0.05, ** P < 0.01 versusthe sham group.
圖2-3 TBI后外周中性粒細胞浸潤腦組織的時間變化TBI后第1天，MPO+中性粒細胞的數(shù)量出現(xiàn)了快速增加，并達到高峰，然后從3天逐漸下降至TB丨后第28天（A、B)。標尺=50nm? *P< 0.05, **P<0.01。Fig. 2-3 Temporal changes of peripheral neutrophils infiltrate the brain after TBI.A rapid increase in the number of MPO+ neutrophils was observed, peaking at the dayafter TBI and then gradually decreasing from day 3 to 28 (A, B). Bar = 50 |im. *P〈 0.05, **F <
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本文編號：2777266
