【摘要】：研究目的:創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)是全世界重要的公共衛(wèi)生問題,其所致的繼發(fā)性損傷促進(jìn)認(rèn)知障礙的發(fā)生發(fā)展。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常駐的免疫細(xì)胞,是對抗疾病或損傷的第一道防線,其激活后的極化狀態(tài)決定了繼發(fā)性損傷和神經(jīng)保護(hù)作用。因此,干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞極化狀態(tài)可能是改善TBI遠(yuǎn)期認(rèn)知障礙的關(guān)鍵靶點(diǎn)。TLRs是介導(dǎo)先天免疫的受體家族,特別是TLR4被認(rèn)為是小膠質(zhì)細(xì)胞活化的主要調(diào)節(jié)因子。TLR4在小膠質(zhì)細(xì)胞中高度表達(dá),在調(diào)節(jié)TBI后慢性炎癥反應(yīng)和啟動繼發(fā)性損傷中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。我所在研究團(tuán)隊前期實(shí)驗發(fā)現(xiàn)TBI慢性期腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞以M1型為主,促進(jìn)神經(jīng)炎癥,引發(fā)認(rèn)知障礙。本課題將進(jìn)一步闡明TLR4在調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化表型,改善TBI遠(yuǎn)期認(rèn)知障礙的作用及機(jī)制,為TBI治療新方法提供理論依據(jù)。研究內(nèi)容與方法:1.通過免疫熒光及Western Blot檢測TLR4,驗證TAK242(TLR4抑制劑)可以有效抑制TLR4的表達(dá);通過改良神經(jīng)功能評分及Morris水迷宮實(shí)驗,評價TLR4的表達(dá)對rmTBI小鼠神經(jīng)功能及遠(yuǎn)期空間學(xué)習(xí)記憶的影響。2.應(yīng)用Western Blot檢測APP、p-Tau蛋白,評價TLR4對rmTBI小鼠病理性蛋白表達(dá)的影響。3.借助免疫熒光及Western Blot技術(shù)在體內(nèi)體外實(shí)驗中檢測M1型小膠質(zhì)細(xì)胞及M2型小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)情況及定量分析;應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測炎癥因子;探討TLR4對rmTBI后急慢性期小膠質(zhì)細(xì)胞極化表型及炎癥因子釋放的影響。4.體內(nèi)體外實(shí)驗,應(yīng)用免疫熒光及Western Blot技術(shù)檢測TLR4及下游蛋白Myd88、NF-κB的表達(dá)變化,明確TLR4及重要下游信號分子Myd88、NF-κB是否參與調(diào)控TBI后小膠質(zhì)細(xì)胞極化表型及神經(jīng)炎癥反應(yīng)。結(jié)果:1.(1)rmTBI急慢性期均出現(xiàn)TLR4表達(dá)升高,TAK242可以有效的抑制TLR4的表達(dá)。(2)rmTBI后急性期小鼠出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺損,隨著損傷時間延長,神經(jīng)功能缺損逐漸恢復(fù);在rmTBI后慢性期出現(xiàn)明顯學(xué)習(xí)記憶能力下降;進(jìn)一步驗證了rmTBI是神經(jīng)退行性疾病的重要危險因素。(3)rmTBI后,抑制TLR4的表達(dá)可以促進(jìn)rmTBI小鼠神經(jīng)功能缺損修復(fù)。(4)rmTBI后,抑制TLR4的表達(dá)可以改善rmTBI小鼠慢性期空間學(xué)習(xí)記憶能力。2.(1)rmTBI后3d即出現(xiàn)病理性蛋白APP,p-Tau蛋白表達(dá)增加,隨著損傷時間延長至28d(慢性期),APP,p-Tau蛋白表達(dá)增加更為顯著。(2)在rmTBI后的急慢性期,抑制TLR4的表達(dá)可減少病理性蛋白APP及p-Tau蛋白的表達(dá)。3.(1)體外實(shí)驗證實(shí):LPS激活小膠質(zhì)細(xì)胞,促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型極化,促炎因子釋放增加,抑炎因子釋放減少;抑制TLR4的表達(dá)可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化,抑炎因子釋放增加,促炎因子釋放減少。(2)體內(nèi)實(shí)驗證實(shí):rmTBI后小膠質(zhì)細(xì)胞激活,急性期M1,M2表達(dá)均有明顯增高,炎癥因子表達(dá)失衡;進(jìn)入慢性期,M1型小膠質(zhì)細(xì)胞仍持續(xù)激活,促炎因子釋放增加,促進(jìn)病理性蛋白累積,引起rmTBI遠(yuǎn)期認(rèn)知障礙。在rmTBI急慢性期,抑制TLR4表達(dá)可使M1/M2比例顯著下降,促進(jìn)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化,增加抑炎因子釋放,減少病理性蛋白的表達(dá),最終改善認(rèn)知功能。4.(1)通過免疫熒光雙標(biāo)記TLR4及小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1,發(fā)現(xiàn)rmTBI后急慢性期較多的TLR4共定位于小膠質(zhì)細(xì)胞,而假手術(shù)組僅有較少的TLR4共定位于小膠質(zhì)細(xì)胞;TAK242干預(yù)后,較PBS組共定位于小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4顯著減少。(2)LPS損傷與rmTBI后,TLR4及下游信號分子蛋白Myd88、NF-κB的表達(dá)均顯著升高,予TAK242干預(yù)后,TLR4及下游信號分子蛋白Myd88、NF-κB的表達(dá)較PBS組有顯著下降,提示TLR4及下游信號因子Myd88、NF-κB參與調(diào)控rmTBI后的小膠質(zhì)細(xì)胞極化及神經(jīng)炎癥反應(yīng)。結(jié)論:1.TBI后,抑制TLR4表達(dá)可下調(diào)其下游信號分子Myd88、NF-κB的表達(dá)水平,降低小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2比例,促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化;其次,抑制TLR4表達(dá)可促進(jìn)抑炎因子釋放,抑制慢性期神經(jīng)炎癥反應(yīng),減輕繼發(fā)性腦損傷,從而導(dǎo)致病理性蛋白APP,p-Tau蛋白表達(dá)減少,最終改善TBI遠(yuǎn)期認(rèn)知障礙。2.TLR4是調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞活化表型的重要模式識別受體,影響神經(jīng)炎癥的進(jìn)展以及神經(jīng)變性的發(fā)生發(fā)展。因此TLR4可能是改善TBI遠(yuǎn)期認(rèn)知障礙的有希望的干預(yù)靶點(diǎn)。3.TAK242是潛在的TBI治療新策略。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R651.15
【圖文】：

2016 年 Nguye[1]等人對世界各國 TBI 發(fā)生率進(jìn)行綜述，研究顯示全球 TBI 的年發(fā)生率為每年 349/10 萬人。TBI 發(fā)生率高，其致殘致死率居創(chuàng)傷之首，是全世界的重要公共衛(wèi)生問題[2, 3]，普遍流行于高收入和中低收入國家并影響著所有年齡段人群。TBI 無論嚴(yán)重程度如何，都涉及大腦內(nèi)一系列復(fù)雜的病理變化，包括神經(jīng)毒性，代謝失衡以及離子和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一般破壞[4]。TBI 病理過程包括兩方面：①原發(fā)性病理改變：腦血管病變和彌漫性軸索損傷；②繼發(fā)性病理改變：主要為神經(jīng)炎癥、低氧血癥、細(xì)胞凋亡壞死、腦水腫等（圖 1）。目前，越來越多的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，TBI 可增加神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病、慢性創(chuàng)傷性腦病、帕金森病等的發(fā)病率[5]。同時越來越多的證據(jù)表明反復(fù)輕度 TBI（repetitivemild Traumatic brain injury,rmTBI)可能導(dǎo)致短期和長期對神經(jīng)功能的不利影響，與遠(yuǎn)期神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生存在緊密聯(lián)系。一系列流行病學(xué)研究已將 TBI 列為神經(jīng)認(rèn)知綜合征的重要危險因素。目前，TBI 后遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙是國際顱腦創(chuàng)傷領(lǐng)域新興的一個研究熱點(diǎn)，研究報道尚少，因此研究其病理機(jī)制及干預(yù)措施，具有重要臨床意義！

擊（CCI）后 1 周增加，而 CD86（+）/ CD11b（+）M1 表型小膠質(zhì)細(xì)胞在 4 周時增加。在 TBI 的小鼠模型中，瞬時 M2 表型小膠質(zhì)細(xì)胞是腦損傷急性期的活化小膠質(zhì)細(xì)胞的初始表型，并且在損傷后 5 天達(dá)到峰值，但 M1 表型小膠質(zhì)細(xì)胞保持升高直至 14 天[15]。在 CCI 后 1 年的小鼠模型中觀察到，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可以在受傷的皮質(zhì)中持續(xù)表達(dá)，伴有病變擴(kuò)張和神經(jīng)變性[16]。在對 TBI 患者大腦 PET 掃描觀察到小膠質(zhì)細(xì)胞激活在創(chuàng)傷后可存在長達(dá) 17 年[17]。本人所在課題組同期研究也發(fā)現(xiàn) TBI 后 M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞持續(xù)升高，而 M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞在損傷后 1 周達(dá)高峰，損傷后 4 周出現(xiàn)顯著下降，在 TBI 慢性期，以 M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞為主，促炎因子釋放增加，促進(jìn)認(rèn)知障礙的發(fā)生[18]。綜上研究，TBI 后活化的小膠質(zhì)細(xì)胞表型從急性激活的 M2表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚L期激活的 M1表型，在 CNS中產(chǎn)生較為持久的免疫炎癥反應(yīng)，引起內(nèi)環(huán)境紊亂，促進(jìn)神經(jīng)變性的發(fā)生，從而導(dǎo)致遠(yuǎn)期認(rèn)知障礙的發(fā)生發(fā)展（見圖 2）。抑制 M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn) M2型小膠質(zhì)細(xì)胞可以改善TBI小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)[19]。因此，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2比例，減輕繼發(fā)性腦損傷，是改善 TBI 遠(yuǎn)期認(rèn)知障礙的重要靶點(diǎn)。

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