發(fā)布時間：2020-06-16 11:38

【摘要】：研究背景與目的肝衰竭是一種因短期內(nèi)肝細胞大量壞死而出現(xiàn)嚴重肝臟功能障礙的臨床綜合征,嚴重危害人類健康。臨床上尚缺乏對肝衰竭有效的藥物治療手段。近年來,免疫介導(dǎo)的肝損傷成為肝衰竭的研究熱點之一,固有免疫和適應(yīng)性免疫共同參與了肝衰竭的發(fā)生發(fā)展過程。布魯頓酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase,Btk)屬于Tec家族的一員,主要表達于除T淋巴細胞和漿細胞以外的免疫細胞中。大量研究顯示,Btk在調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答、調(diào)控炎癥因子表達中具有重要作用。本研究將利用兩種不同的小鼠急性肝衰竭模型驗證Btk抑制劑可能的保護效應(yīng),并探討其中的作用機制。旨在明確Btk抑制劑對小鼠急性肝衰竭的保護作用,驗證Btk作為急性肝衰竭治療靶點的可能性和有效性,為臨床肝衰竭的診治提供新的方法與手段。研究方法第一部分:在兩種不同的Btk抑制劑(依魯替尼與艾拉替尼)處理后,分別利用脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)聯(lián)合 D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-GalN)、刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA)建立兩種不同的小鼠急性肝衰竭模型,收集血清測定谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase,AST),通過蘇木素-伊紅染色評價肝臟病理變化;分別利用熒光定量PCR技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)分析小鼠肝臟、RAW264.7 細胞系、人原代 CD14+單核細胞中Btk抑制劑對炎癥刺激下細胞因子的影響。第二部分:利用Romas細胞系、THP-1細胞系、L02細胞系檢測Btk在肝細胞內(nèi)的表達,并通過人肝組織的免疫組織化學(xué)分析結(jié)果確定Btk在肝臟中的表達情況;利用Western Blot技術(shù)和流式細胞技術(shù)明確p-Btk在炎癥刺激下的表達變化;利用熒光定量PCR技術(shù)驗證RAW264.7細胞在LPS刺激下多種細胞因子的表達變化;利用 Western Blot 技術(shù)分析 NOD 樣受體蛋白 3(NOD-Like Receptor Protein 3,NLRP3)、核因子κB(Nuclear Factor-KB,NF-KB)表達變化,并利用熒光定量PCR技術(shù)分析mRNA水平變化;通過流式細胞技術(shù)分析小鼠肝臟T淋巴細胞亞群上CD69的表達,B淋巴細胞和樹突狀細胞(Dendritic Cell,DC)上CD80、CD86的表達。研究結(jié)果第一部分:Btk抑制劑可降低LPS/D-GalN和ConA模型下ALT、AST的上升,并改善小鼠肝臟壞死和炎癥浸潤情況;Btk抑制劑對TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10有良好的抑制作用。第二部分:Btk不表達于肝細胞;炎癥刺激會引起B(yǎng)tk磷酸化水平的劇烈變化;除了 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-10 以外,Btk 抑制劑對 LPS 刺激下 IL-2、IL-4、IFN-γ等因子的表達也有良好的抑制作用;體內(nèi)及體外實驗中Btk抑制劑可以通過抑制NLRP3炎性小體的激活從而減少IL-1β的表達;Btk抑制劑可通過抑制B淋巴細胞和DCs上CD86的表達從而影響T淋巴細胞的激活。研究結(jié)論1)Btk抑制劑可保護小鼠急性肝衰竭,Btk作為抗急性肝衰竭藥物靶點具有良好的可行性與有效性;2)Btk抑制劑通過抑制NLRP3炎性小體激活從而降低IL-1β的表達,緩解“細胞因子風(fēng)暴”的發(fā)生,從而減少肝細胞大量壞死;3)Btk抑制劑可抑制抗原提呈功能,減少T淋巴細胞激活,從而減輕T淋巴細胞介導(dǎo)的肝臟損傷。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575.3
【圖文】：

在觀察到兩種Ｂｔｋ抑制劑對ＬＰＳ／Ｄ－ＧａｌＮ介導(dǎo)的小鼠急性肝衰竭均具有良好的逡逑保護作用之后，我們利用熒光定量ＰＣＲ技術(shù)檢測了小鼠肝臟組織促炎因子ＴＮＦ－ｃｕ逡逑ＩＬ－ｉｐ、ＩＬ－６和抑炎因子ＩＬ－１０的表徶情況。如圖２所示，與ＮＣ組小鼠相比，逡逑ＬＰＳ／Ｄ－ＧａｌＮ組小鼠肝臟組織細胞因子ＴＮＦ－ｃｕ邋ＩＬ－ｌｐ、ＩＬ－６、ＩＬ－１０等ｍＲＮＡ水平逡逑均明顯上升，而Ｂｔｋ抑制劑的應(yīng)用可有效降低ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－ｉｐ、ＩＬ－６的ｍＲＮＡ水平，逡逑ＩＬ－１０符合趨勢但是無統(tǒng)計學(xué)意義。這表明，Ｂｔｋ抑制劑能調(diào)節(jié)促炎因子的表徶，逡逑改善ＬＰＳ／Ｄ－ＧａｌＮ對肝臟免疫微環(huán)境的影響。逡逑２６逡逑

細胞內(nèi)Ｂｔｋ磷酸化水平在ＬＰＳ刺激下的表達變化。我們將ＲＡＷ２６４．７細胞分為四逡逑組，分別為ＮＣ組、Ａｃ－Ｉｂ組、ＬＰＳ組及Ａｃ－Ｉｂ＋ＬＰＳ組，處理６小時后，收集細胞逡逑并提取蛋白，利用＂ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ檢測了邋ｐ－Ｂｔｋ／Ｂｔｋ的表達水平。如圖３Ａ所示，與逡逑ＮＣ組相比，ＬＰＳ可明顯提高巨噬細胞內(nèi)Ｂｔｋ磷酸化水平而幾乎不影響Ｂｔｋ總蛋白逡逑的表達水平；通過Ｂｔｋ抑制劑的預(yù)處理，可明顯降低ＬＰＳ作用下的這一磷酸化過逡逑程。表明，ＬＰＳ可刺激巨噬細胞內(nèi)Ｂｔｋ磷酸化水平的升高，這可能與ＬＰＳ的促炎逡逑作用有關(guān)；利用Ｂｔｋ抑制劑可能可以緩解巨噬細胞引起的炎癥反應(yīng)。逡逑下一步，我們分析了邋ＬＰＳ刺激下Ｂｔｋ抑制劑對ＲＡＷ２６４．７細胞內(nèi)細胞因子表逡逑達水平的影響。我們將ＲＡＷ２６４．７細胞同樣分為四組，分別為ＮＣ組、Ａｃ－Ｉｂ組、逡逑ＬＰＳ組及Ａｃ－Ｉｂ＋ＬＰＳ組，處理６小時后，收集細胞并提取ＲＮＡ，利用熒光定量ＰＣＲ逡逑檢測ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－ｉｐ、ＩＬ－６和ＩＬ－１０的表達水平。結(jié)果如圖３Ｂ－Ｅ示，與ＮＣ組相比，逡逑單一邋Ａｃ－Ｉｂ處理對四種細胞因子的ｎｉＲＮＡ均有輕微升高作用

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