【摘要】：研究背景與目的肝衰竭是一種因短期內(nèi)肝細(xì)胞大量壞死而出現(xiàn)嚴(yán)重肝臟功能障礙的臨床綜合征,嚴(yán)重危害人類健康。臨床上尚缺乏對(duì)肝衰竭有效的藥物治療手段。近年來(lái),免疫介導(dǎo)的肝損傷成為肝衰竭的研究熱點(diǎn)之一,固有免疫和適應(yīng)性免疫共同參與了肝衰竭的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。布魯頓酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase,Btk)屬于Tec家族的一員,主要表達(dá)于除T淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞以外的免疫細(xì)胞中。大量研究顯示,Btk在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答、調(diào)控炎癥因子表達(dá)中具有重要作用。本研究將利用兩種不同的小鼠急性肝衰竭模型驗(yàn)證Btk抑制劑可能的保護(hù)效應(yīng),并探討其中的作用機(jī)制。旨在明確Btk抑制劑對(duì)小鼠急性肝衰竭的保護(hù)作用,驗(yàn)證Btk作為急性肝衰竭治療靶點(diǎn)的可能性和有效性,為臨床肝衰竭的診治提供新的方法與手段。研究方法第一部分:在兩種不同的Btk抑制劑(依魯替尼與艾拉替尼)處理后,分別利用脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)聯(lián)合 D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-GalN)、刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA)建立兩種不同的小鼠急性肝衰竭模型,收集血清測(cè)定谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase,AST),通過(guò)蘇木素-伊紅染色評(píng)價(jià)肝臟病理變化;分別利用熒光定量PCR技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)分析小鼠肝臟、RAW264.7 細(xì)胞系、人原代 CD14+單核細(xì)胞中Btk抑制劑對(duì)炎癥刺激下細(xì)胞因子的影響。第二部分:利用Romas細(xì)胞系、THP-1細(xì)胞系、L02細(xì)胞系檢測(cè)Btk在肝細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),并通過(guò)人肝組織的免疫組織化學(xué)分析結(jié)果確定Btk在肝臟中的表達(dá)情況;利用Western Blot技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)明確p-Btk在炎癥刺激下的表達(dá)變化;利用熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證RAW264.7細(xì)胞在LPS刺激下多種細(xì)胞因子的表達(dá)變化;利用 Western Blot 技術(shù)分析 NOD 樣受體蛋白 3(NOD-Like Receptor Protein 3,NLRP3)、核因子κB(Nuclear Factor-KB,NF-KB)表達(dá)變化,并利用熒光定量PCR技術(shù)分析mRNA水平變化;通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)分析小鼠肝臟T淋巴細(xì)胞亞群上CD69的表達(dá),B淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell,DC)上CD80、CD86的表達(dá)。研究結(jié)果第一部分:Btk抑制劑可降低LPS/D-GalN和ConA模型下ALT、AST的上升,并改善小鼠肝臟壞死和炎癥浸潤(rùn)情況;Btk抑制劑對(duì)TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10有良好的抑制作用。第二部分:Btk不表達(dá)于肝細(xì)胞;炎癥刺激會(huì)引起B(yǎng)tk磷酸化水平的劇烈變化;除了 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-10 以外,Btk 抑制劑對(duì) LPS 刺激下 IL-2、IL-4、IFN-γ等因子的表達(dá)也有良好的抑制作用;體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)中Btk抑制劑可以通過(guò)抑制NLRP3炎性小體的激活從而減少IL-1β的表達(dá);Btk抑制劑可通過(guò)抑制B淋巴細(xì)胞和DCs上CD86的表達(dá)從而影響T淋巴細(xì)胞的激活。研究結(jié)論1)Btk抑制劑可保護(hù)小鼠急性肝衰竭,Btk作為抗急性肝衰竭藥物靶點(diǎn)具有良好的可行性與有效性;2)Btk抑制劑通過(guò)抑制NLRP3炎性小體激活從而降低IL-1β的表達(dá),緩解“細(xì)胞因子風(fēng)暴”的發(fā)生,從而減少肝細(xì)胞大量壞死;3)Btk抑制劑可抑制抗原提呈功能,減少T淋巴細(xì)胞激活,從而減輕T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的肝臟損傷。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R575.3
【圖文】：

在觀察到兩種Ｂｔｋ抑制劑對(duì)ＬＰＳ／Ｄ－ＧａｌＮ介導(dǎo)的小鼠急性肝衰竭均具有良好的逡逑保護(hù)作用之后，我們利用熒光定量ＰＣＲ技術(shù)檢測(cè)了小鼠肝臟組織促炎因子ＴＮＦ－ｃｕ逡逑ＩＬ－ｉｐ、ＩＬ－６和抑炎因子ＩＬ－１０的表徶情況。如圖２所示，與ＮＣ組小鼠相比，逡逑ＬＰＳ／Ｄ－ＧａｌＮ組小鼠肝臟組織細(xì)胞因子ＴＮＦ－ｃｕ邋ＩＬ－ｌｐ、ＩＬ－６、ＩＬ－１０等ｍＲＮＡ水平逡逑均明顯上升，而Ｂｔｋ抑制劑的應(yīng)用可有效降低ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－ｉｐ、ＩＬ－６的ｍＲＮＡ水平，逡逑ＩＬ－１０符合趨勢(shì)但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明，Ｂｔｋ抑制劑能調(diào)節(jié)促炎因子的表徶，逡逑改善ＬＰＳ／Ｄ－ＧａｌＮ對(duì)肝臟免疫微環(huán)境的影響。逡逑２６逡逑

細(xì)胞內(nèi)Ｂｔｋ磷酸化水平在ＬＰＳ刺激下的表達(dá)變化。我們將ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞分為四逡逑組，分別為ＮＣ組、Ａｃ－Ｉｂ組、ＬＰＳ組及Ａｃ－Ｉｂ＋ＬＰＳ組，處理６小時(shí)后，收集細(xì)胞逡逑并提取蛋白，利用＂ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ檢測(cè)了邋ｐ－Ｂｔｋ／Ｂｔｋ的表達(dá)水平。如圖３Ａ所示，與逡逑ＮＣ組相比，ＬＰＳ可明顯提高巨噬細(xì)胞內(nèi)Ｂｔｋ磷酸化水平而幾乎不影響Ｂｔｋ總蛋白逡逑的表達(dá)水平；通過(guò)Ｂｔｋ抑制劑的預(yù)處理，可明顯降低ＬＰＳ作用下的這一磷酸化過(guò)逡逑程。表明，ＬＰＳ可刺激巨噬細(xì)胞內(nèi)Ｂｔｋ磷酸化水平的升高，這可能與ＬＰＳ的促炎逡逑作用有關(guān)；利用Ｂｔｋ抑制劑可能可以緩解巨噬細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)。逡逑下一步，我們分析了邋ＬＰＳ刺激下Ｂｔｋ抑制劑對(duì)ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表逡逑達(dá)水平的影響。我們將ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞同樣分為四組，分別為ＮＣ組、Ａｃ－Ｉｂ組、逡逑ＬＰＳ組及Ａｃ－Ｉｂ＋ＬＰＳ組，處理６小時(shí)后，收集細(xì)胞并提�。遥危粒脽晒舛浚校茫义义蠙z測(cè)ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－ｉｐ、ＩＬ－６和ＩＬ－１０的表達(dá)水平。結(jié)果如圖３Ｂ－Ｅ示，與ＮＣ組相比，逡逑單一邋Ａｃ－Ｉｂ處理對(duì)四種細(xì)胞因子的ｎｉＲＮＡ均有輕微升高作用

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本文編號(hào)：2715993