【摘要】：目的： 本課題組前期研究已證實骨髓間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）移植治療能夠促進心肌梗死后梗死交界區(qū)域微血管生成，改善心肌梗死后的心功能。然而，由于移植MSCs在心肌梗死區(qū)存活率低，以及心梗區(qū)炎癥反應，使得大量的移植細胞快速凋亡等諸多問題，大大降低其治療效果。近年研究顯示高遷移率組蛋白1（High Mobility Group Box-1，HMGB1）可以通過調(diào)節(jié)損傷組織的促進血管生成相關因子和炎癥因子的表達，可能進一步刺激干細胞的增殖、分化和旁分泌效應，而參與組織的損傷修復。因此，本研究擬在大鼠急性心肌梗死的模型上，通過注射HMGB1及拮抗HMGB1表達，同時聯(lián)合移植MSCs，觀察HMGB1聯(lián)合MSCs移植是否能進一步改善梗死區(qū)域局部微環(huán)境、增強干細胞的旁分泌效應，以期更好地發(fā)揮干細胞修復心肌的作用。 方法： 通過貼壁離心法培養(yǎng)獲得高純度大鼠MSCs；進行細胞表型鑒定；SD雄性大鼠共144只，隨機分為六組：正常對照組、模型對照組、MSCs移植組、HMGB1注射組、HMGB1注射+MSCs移植組、HMGB1BoxA注射+MSCs移植組(n=24只)。制備大鼠急性心肌梗死模型，按照造模成功后心肌內(nèi)注射1.0×106個MSCs、結(jié)扎冠脈左前降支前后腹膜內(nèi)各注射1次100ng HMGB1（10μg/ml）、MSCs移植聯(lián)合HMGB1注射、MSCs移植同時腹膜內(nèi)注射HMGB1BoxA400μg給藥方法分別處理。術后3天，7天，28天ELISA法檢測血清TLR4、VEGF、IL-6、NF-b、TNF-α、HMGB1濃度水平。術后28天心臟彩超測定心臟功能，心臟切片染色觀察病理改變，TTC染色測定心梗面積、梗死區(qū)新生血管免疫組化測定梗死區(qū)新生血管密度。 結(jié)果： 1、心功能：術后28天各組行超聲心動圖檢測LVDd、LVDs、FS和EF值，結(jié)果顯示，與MSCs移植組、HMGB1注射組、HMGB1BoxA注射+MSCs移植組比較，HMGB1注射+MSCs移植組的心功能改善最為顯著，LVDd和LVDs明顯縮小，F(xiàn)S和EF值增加（P0.05）；余組心功能改善情況依次為：MSCs移植組＞HMGB1BoxA注射+MSCs移植組＞HMGB1注射組＞模型對照組（P0.05）。 2、梗死面積測定：術后28天心肌TTC染色顯示HMGB1注射+MSCs移植組的梗死面積較藥物干預其它三組明顯減��；余組梗死面積測定值依次為：模型對照組＞HMGB1注射組＞HMGB1BoxA注射+MSCs移植組＞MSCs移植組（P0.05）； 3、心肌梗死區(qū)新生血管測定：HMGB1注射+MSCs移植組的CD31染色新生血管數(shù)較藥物干預其它三組明顯增多；余組新生血管測定值依次為：MSCs移植組＞HMGB1BoxA注射+MSCs移植組＞HMGB1注射組＞模型對照組（P0.05）。 4、血清TLR4、VEGF及HMGB1水平：血清HMGB1測定值術后3天、7天時間點依次為：模型對照組＞MSCs移植組；血清TLR4、VEGF測定值術后3天時間點依次為：HMGB1注射+MSCs移植組＞MSCs移植組＞HMGB1BoxA注射+MSCs移植組＞HMGB1注射組＞模型對照組，術后7天時間點依次為：HMGB1注射+MSCs移植組＞MSCs移植組＞HMGB1注射組＞HMGB1BoxA注射+MSCs移植組＞模型對照組；28天時間點上TLR4、VEGF及HMGB1各濃度水平各組無統(tǒng)計學差異（P0.05）。 5、血清IL-6、NF-b及TNF-α水平：血清IL-6、NF-b及TNF-α測定值術后3天時間點依次為：HMGB1注射組＞模型對照組＞HMGB1注射+MSCs移植組＞MSCs移植組＞HMGB1BoxA注射+MSCs移植組，術后7天時間點依次為：模型對照組＞HMGB1注射組＞MSCs移植組＞HMGB1BoxA注射+MSCs移植組＞HMGB1注射+MSCs移植組，28天時間點上IL-6、NF-b及TNF-α各濃度水平各組無統(tǒng)計學差異（P0.05）。 結(jié)論： HMGB1聯(lián)合MSCs移植治療比較單MSCs移植治療及單HMGB1注射治療對梗死心肌局部促進血管生成因子的表達增加，炎癥因子的表達減少。從而對大鼠急性心肌梗死后心功能改善、心肌梗死面積減少和局部新生血管生成等更為有益，而拮抗HMGB1后上述作用明顯削弱。
【學位授予單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R542.22
【圖文】：

2.1 MSCs 的培養(yǎng)、鑒定、標記2.1.1 MSCs 的培養(yǎng)原代培養(yǎng)過程中觀察可見密集圓形細胞，含各種骨髓原始細胞。第 3 天換液，可見部分細胞貼壁，可見有少量細胞由圓形變?yōu)槎嘟切位蚨贪魻�，呈集落狀分布；�?~6 天，可見多角形或短棒狀的細胞逐漸增多，細胞體積增大，可觀察到分化完整細胞器，并逐漸擴散、相互交聯(lián)；至 7 天左右，全部細胞均為梭形，且呈渦流狀，排列細胞部分融合，可鋪滿瓶底達 80%-90%。細胞傳至第 3 代時，倒置顯微鏡下可見細胞形態(tài)逐漸均勻生長成為梭形，形態(tài)趨于一致，且分布均勻。細胞的增殖速度較原代明顯增快，當細胞傳代至 4 代以后，細胞生長趨于緩慢，形態(tài)有衰老趨勢（圖 1）。2 實驗結(jié)果

22圖 2 流式細胞術鑒定 MSCs 流式細胞儀分析顯示多數(shù) MSCs 細胞表達 CD29 和 CD90，極少數(shù)細胞表達 CD45Figure 2 Surface antigen of MSCs measured by Flow Cytometry, and MSCs expressing CD90 andCD29, little expressing CD452.1.3 DAPI 標記 MSCs選用第 3 代生長狀態(tài)良好的 MSCs 細胞，予 DAPI 染色，觀察到 MSCs 細胞染色成功，細胞核藍色熒光表現(xiàn)。400 倍高倍鏡下隨機選取 3 個高倍視野計數(shù)，以鏡下平均數(shù)計算標記率為 94%（圖 3）。

【參考文獻】

相關期刊論文 前7條

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本文編號：2715543