發(fā)布時間：2020-03-26 08:24

【摘要】：背景急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是繼發(fā)于感染、創(chuàng)傷及休克等多種病理損傷的臨床綜合征,以進(jìn)行性低氧血癥和呼吸困難為主要臨床表現(xiàn)。2012年柏林定義中ARDS輕、中、重度患者死亡率分別達(dá)27%、32%和45%,肺部進(jìn)行性纖維增生是影響ARDS患者存活率及預(yù)后的一個重要因素。但是至今ARDS肺纖維性增生進(jìn)程及其機(jī)制尚未完全闡明,且沒有理想的治療方法。因此,對ARDS肺纖維化發(fā)生機(jī)制和有效藥物的研究具有非常重要的科學(xué)價值。有研究表明轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是導(dǎo)致纖維化的關(guān)鍵因子,Smads信號傳導(dǎo)通路在纖維化的發(fā)展進(jìn)程中同樣重要。同時越來越多研究顯示氧化應(yīng)激是肺纖維化的重要機(jī)制之一,而在ARDS的病程中,自由基尤其氧自由基等氧化應(yīng)激反應(yīng)對疾病發(fā)展有重要意義,如能早期促進(jìn)氧自由基清除,或許可抑制肺纖維化,改善ARDS預(yù)后。依達(dá)拉奉(edaravone,EDA)是強(qiáng)效自由基清除劑,在急性腦梗死患者中已廣泛應(yīng)用。近年來發(fā)現(xiàn)它對肺損傷也有保護(hù)作用。因此,我們通過構(gòu)建脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)大鼠ARDS模型,從病理學(xué)、分子生物學(xué)角度探討EDA能否通過抗氧自由基效應(yīng),在ARDS早期抑制肺纖維性增生,并闡明其可能的作用機(jī)制。目的探討EDA調(diào)控TGF-β1/Smads信號傳導(dǎo)通路的作用機(jī)制,可進(jìn)一步闡明氧化應(yīng)激在ARDS早期肺纖維性增生的作用,為該領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和臨床治療提供依據(jù)。方法96只雄性SD大鼠,隨機(jī)分為三組(n=32):假手術(shù)組(Sham組)、脂多糖組(LPS組)和脂多糖+依達(dá)拉奉組(簡稱EDA組),各組再分為1、7、14和28天共四個時間點(diǎn),每個時間點(diǎn)每組8只。LPS組及EDA組經(jīng)尾靜脈予注射LPS 5mg/kg,Sham組用同樣方法給予等容量生理鹽水。在注射完LPS后,EDA組即經(jīng)腹腔內(nèi)注入EDA 6mg/kg進(jìn)行干預(yù),并用同樣劑量連續(xù)給藥7天。Sham組和LPS組則在相應(yīng)觀察時間點(diǎn)予等容量生理鹽水腹腔注射。大鼠在各觀察點(diǎn)腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉,經(jīng)心臟取血后處死大鼠,測量雙肺濕重,計(jì)算肺指數(shù),留取肺組織待檢。肺組織用甲醛固定,石蠟包埋,然后行蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosine,HE)染色,觀察病理性炎癥改變;Masson染色,評估纖維性增生的分布;免疫組化觀察α-平滑肌動蛋白(α-smooth muscle actin proteins,α-SMA)及膠原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ,ColⅠ)表達(dá)水平。肺組織中羥脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量采用堿水解法檢測。采用RT-qPCR和WB法分別檢測肺組織中TGF-β1 mRNA、Smad3和Smad4蛋白表達(dá)水平。ELISA法測定肺組織ColⅠ,TGF-β1,TNF-α和IL6含量。用硫代巴比妥酸(TBA)法、黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)及比色法分別檢測肺組織中MDA,SOD和GSH-PX的表達(dá)。結(jié)果1.大鼠一般情況:Sham組大鼠對刺激反應(yīng)靈敏,活動正常,呼吸平順,攝食、飲水正常,毛色光澤,體重逐漸增加;LPS組反應(yīng)逐漸遲鈍,活動減少,弓背蜷縮在籠子一角,呼吸加快、加深,攝食和飲水量減少。上述異常表現(xiàn),LPS組可持續(xù)約7天,EDA組可持續(xù)約5天,隨后對刺激的反應(yīng)逐漸變好,體重漸漸增加,活動增多。2.肺指數(shù):與Sham組相比,LPS組大鼠相應(yīng)時間點(diǎn)肺指數(shù)明顯增加;與LPS組相比,從第7天開始,EDA組大鼠肺指數(shù)有一定程度的下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.病理形態(tài)學(xué):Sham組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰,肺泡間隔正常,無炎癥細(xì)胞浸潤,無充血、水腫等。與Sham組相比,LPS組肺泡間隔水腫,肺泡壁明顯增厚,泡壁中可見有明顯的炎性細(xì)胞浸潤,部分肺泡代償性擴(kuò)張,各級支氣管壁周有膠原纖維沉積,肺泡壁有局灶性的纖維性增生,未見有彌漫性肺纖維化形成。與LPS組比較,EDA組肺組織炎癥及纖維性增生的程度有不同程度的改善。4.TGF-β1/Smads信號傳導(dǎo)通路:與Sham組比較,LPS組大鼠肺組織TGF-β1mRNA,Smad3和Smad4蛋白表達(dá)水平,以及血清中TGF-β1蛋白表達(dá)量均有明顯上升。與LPS組對比,EDA組在同時間點(diǎn)TGF-β1 mRNA,TGF-β1,Smad3和Smad4蛋白有不同程度的下降。5.炎性因子表達(dá):LPS組和EDA組大鼠血清中TNF-α,IL-6含量在第1天就有明顯上升,之后又逐漸降低。與同時間點(diǎn)Sham組比較,LPS組TNF-α,IL-6含量均明顯增加;與LPS組相比,EDA組TNF-α,IL-6含量有明顯減少。6.氧化應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)志物:LPS組和EDA組大鼠在1天后,肺組織MDA含量均明顯升高,以第7天含量最高,之后又逐漸降低。與同時間點(diǎn)的Sham組比較,LPS組大鼠肺組織MDA含量明顯增加;EDA組與同時間點(diǎn)的LPS組相比,大鼠肺組織中MDA含量明顯減少。與Sham組比較,兩種抗氧化物質(zhì)(SOD,GSH-PX)在第1天開始就明顯下降,LPS組SOD逐漸降低,GSH-PX在第7天降至最低,然后逐漸恢復(fù);與LPS組相比,EDA在相同時間點(diǎn)SOD,GSH-PX含量均明顯降低。結(jié)論在ARDS大鼠模型中,依達(dá)拉奉能有效地抑制ARDS肺部炎癥及早期的纖維性增生反應(yīng),其可能的機(jī)制為通過抗氧自由基效應(yīng),改善機(jī)體炎癥反應(yīng),從而抑制TGF-β1/Smads信號傳導(dǎo)通路,繼而減輕肺組織的纖維性增生。
【圖文】：

蜷縮在籠子一角，呼吸加快、加深，攝食和飲水量減少。上述持續(xù)約 7 天，EDA 組可持續(xù)約 5 天，隨后對刺激的反應(yīng)逐漸體重逐漸增加。兩組大鼠在第 5 天后，有部分出現(xiàn)斷尾。變化情況表 15 三組大鼠不同時間點(diǎn)肺指數(shù)變化（mg/g, n=8, x—±s） 1d 7d 14d 組 6.78±0.23 5.94±0.29 5.95±0.39 5組 8.45±0.34**11.25±1.07**12.20±0.41**13組 8.09±0.46 9.31±0.72##10.17±0.84##11ham 組相比，**p＜0.01；與 LPS 組比較，##p＜0.01；Sham 組：假手術(shù)糖組；EDA 組：依達(dá)拉奉組

3. 肺組織炎癥和纖維性增生的判定3.1 HE 染色結(jié)果Sham 組大鼠肺內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔無增厚，無充血、水腫，無炎癥細(xì)胞浸潤，各時間點(diǎn)均無明顯病理改變。LPS 組第 1 天可見肺毛細(xì)血管充血，，肺泡間隔水腫，肺泡壁明顯增厚，泡壁中可見有明顯的炎性細(xì)胞浸潤，部分肺泡代償性擴(kuò)張，細(xì)支氣管中上皮細(xì)胞有些脫落。第 7 天炎癥表現(xiàn)最明顯，可見纖維母細(xì)胞增生，部分肺泡壁中開始出現(xiàn)纖維結(jié)締組織，少量淋巴細(xì)胞浸潤。第 14 天肺炎癥有減輕，肺組織結(jié)構(gòu)破壞，可見新生的纖維母細(xì)胞灶，肺泡間隔斷裂并增厚。第 28 天肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，可見膠原纖維增生明顯。EDA 組與同時間點(diǎn)的 LPS 組相比較，在第 1 天無明顯區(qū)別，其它時間點(diǎn)肺組織病理變化有不同程度的改善。（見圖 2）
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R563.8

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6 馬胤U

本文編號：2601194