【摘要】：研究背景與目的：成纖維細(xì)胞(fibroblasts)是創(chuàng)面修復(fù)中重要的細(xì)胞,主要來源于結(jié)締組織,可合成及分泌膠原纖維、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維及有機(jī)基質(zhì)等機(jī)能。肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast)是一種來源于成纖維細(xì)胞的高度分化型細(xì)胞。它的功能是產(chǎn)生力量和改變組織張力,在傷口愈合或纖維化器官的細(xì)胞外基質(zhì)中主要負(fù)責(zé)組織收縮。這些具有收縮特點(diǎn)的細(xì)胞可以上調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白比如Ⅰ型膠原(Collagen I),并且高度表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(aSMA)。在生理情況下,這是創(chuàng)傷愈合的可靠標(biāo)志,也是創(chuàng)面愈合過程中結(jié)締組織重塑和纖維化形成的關(guān)鍵。然而病理情況下,比如創(chuàng)面較大或存在異常的炎癥反應(yīng)時(shí),肌成纖維細(xì)胞分化不受控制,持續(xù)存在則會(huì)引起創(chuàng)面的過度收縮導(dǎo)致增生性瘢痕,如發(fā)生在關(guān)節(jié)等活動(dòng)部位則極易導(dǎo)致瘢痕攣縮,嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。更有文獻(xiàn)表明它的存在與器官纖維化,促進(jìn)腫瘤生長也有直接關(guān)系。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)基于其較高的誘導(dǎo)增殖分化潛能,被廣泛應(yīng)用于組織損傷修復(fù)領(lǐng)域。然而仍存在細(xì)胞來源匱乏,傳代后增殖分化潛能明顯下降,與其提取、制備等成本相比效果并不顯著,使得推廣陷入瓶頸。這就要求人們從新的視角,進(jìn)一步闡明MSCs作用于創(chuàng)面修復(fù)的機(jī)制,以便為改良優(yōu)化干細(xì)胞的治療策略提供新靶點(diǎn)。外泌體(Exosome)作為旁分泌的一個(gè)重要組成部分,是由各種活體細(xì)胞分泌的大小約為50-150nm膜性囊泡,與質(zhì)膜融合后,以胞吐形式釋放入胞外環(huán)境中。當(dāng)外泌體和靶細(xì)胞接觸后,外泌體及其攜帶的生物分子以胞吞的形式被接收并發(fā)揮作用。在外泌體所攜帶的生物分子中,微小非編碼RNA (miRNAs)因其在基因表達(dá)調(diào)控上具有重要作用而受到廣泛關(guān)注。最新研究證實(shí),供體細(xì)胞的miRNAs可以通過外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的形式被靶細(xì)胞接收,并在其內(nèi)“重編程”相關(guān)的靶基因。此外外泌體還提供了保護(hù)作用,可使其攜帶的miRNAs在高溫、酸堿、反復(fù)凍融等惡劣環(huán)境條件下保持穩(wěn)定。這種miRNAs在生物體內(nèi)定向轉(zhuǎn)運(yùn)與保護(hù)機(jī)制的發(fā)現(xiàn),開辟了miRNAs研究領(lǐng)域的新篇章,結(jié)合外泌體精準(zhǔn)且高效的作用機(jī)制和易于保存和調(diào)控的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),使得Exosome-miRNAs的靶向治療具備極高的商品化潛能和轉(zhuǎn)化應(yīng)用前景。現(xiàn)階段對于MSCs外泌體的研究在國內(nèi)外方興未艾。鑒于MSCs可以用于大創(chuàng)面組織缺損的修復(fù),可以加快創(chuàng)面的愈合并且減輕瘢痕的形成,而外泌體是含其細(xì)胞內(nèi)來源活性物質(zhì)的微囊泡,我們推測外泌體是MSCs在創(chuàng)面修復(fù)的細(xì)胞治療中的重要媒介,而外泌體介導(dǎo)的miRNAs轉(zhuǎn)運(yùn)可能在此過程中的某些階段發(fā)揮重要作用。本課題主要研究了以下內(nèi)容：第一部分臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體抽提與鑒定實(shí)驗(yàn)方法：用分次超速離心法加過濾法分離外泌體。通過逐漸增加離心力度將細(xì)胞、細(xì)胞碎片以及較大的顆粒依次去除,然后用孔徑為200μm的濾膜過濾一次,最后至少2小時(shí),并且以100000×g的超速離心速度將外泌體沉淀出。運(yùn)用Western Blot、 BCA、Nanosight等技術(shù)鑒定抽提的外泌體是否純凈。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：Western blot結(jié)果顯示外泌體的標(biāo)記性蛋白CD63、CD81表達(dá)量顯著升高;Nanosight顯示外泌體直徑分布于100nm左右,并且濃度在2000μg/ml。第二部分 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體對成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化的作用實(shí)驗(yàn)方法：首先構(gòu)建小鼠背部皮膚全層創(chuàng)面缺損模型,將實(shí)驗(yàn)分為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組(uMSC組)、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體組(uMSC-Exo)、PBS組、無處理組。通過第7、14、21日測量創(chuàng)面面積以及免疫組化檢測αSMA表達(dá)量驗(yàn)證臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對于創(chuàng)面的修復(fù)速度以及肌成纖維細(xì)胞的含量；其次通過用TGFβ誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化,并在此過程中干預(yù)uMSC-Exo,收集細(xì)胞后通過qRT-PCR、 Western Blot、流式抗體細(xì)胞檢測uMSC-Exo對肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志性蛋白αSMA的表達(dá)量變化。并運(yùn)用劃痕以及細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測成纖維細(xì)胞增殖能力的區(qū)別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：體內(nèi)動(dòng)物模型顯示uMSC組與uMSC-Exo組對于創(chuàng)面愈合速度沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,并且肌成纖維細(xì)胞的含量也基本一致。這說明uMSC-Exo可以發(fā)揮干細(xì)胞樣的功能,并且與其相來源的干細(xì)胞功能基本沒有差別。從體外的細(xì)胞模型中,qRT-PCR與Western Blot都檢測出uMSC-Exo可以減少αSMA以及Collagen Ⅰ的表達(dá)；并且劃痕和流式細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)證明uMSC-Exo可以加快成纖維細(xì)胞的遷移與增殖能力。第三部分外泌體的成分鑒定及各成分對成纖維細(xì)胞增殖分化的作用實(shí)驗(yàn)方法：通過蛋白質(zhì)酶或核酸酶的裂解,將外泌體中蛋白質(zhì)或核酸成分去除,使其成為去蛋白質(zhì)外泌體(uMSC-Exo-PROnase)或者去核酸外泌體(uMSC-Exo-RNAse),并通過細(xì)胞周期檢測這兩者對成纖維細(xì)胞增殖能力的差異；通過Western Blot以及qRT-PCR檢測兩組對肌成纖維細(xì)胞分化αSMA蛋白表達(dá)水平的差異,以及通過3D膠原回縮驗(yàn)證這兩者對于肌成纖維細(xì)胞收縮能力的區(qū)別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：凝膠電泳顯示蛋白酶消化后的uMSC-Exo中只剩下核酸成分,并且大部分100bp,這說明uMSC-Exo中的核酸大部分為microRNA。隨后采用Western Blot以及qRT-PCR等技術(shù)證明出uMSC-Exo-PROnase干預(yù)細(xì)胞模型后,αSMA表達(dá)量顯著降低,而uMSC-Exo-RNAse的αSMA則未有明顯變化。這說明uMSC-Exo中的microRNA成分主要可以抑制肌成纖維細(xì)胞的分化；而細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)中顯示uMSC-Exo-RNAse組相較于uMSC-Exo-PROnase組細(xì)胞活力明顯增快,這說明uMSC-Exo可能是通過其中的蛋白成分加速了對成纖維細(xì)胞增殖的能力。這也很好的證明了第一部分的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)即uMSC-Exo可以加快創(chuàng)面的愈合也可以減輕瘢痕的現(xiàn)象。第四部分臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體中miRNA的檢測及通路預(yù)測實(shí)驗(yàn)方法：通過高通量測序,以HEK293細(xì)胞的外泌體為對照,全面檢測uMSC-Exo中miRNA的含量及豐度。利用現(xiàn)有的GEO數(shù)據(jù)(gse46989和gse56862)分析uMSC以及HEK293細(xì)胞的miRNA豐度。依據(jù)課題設(shè)計(jì)篩選在肌成纖維細(xì)胞分化調(diào)控中發(fā)揮重要作用的mRNA作為候選靶基因,并通過TargetScan、GO、Pathway等預(yù)測軟件預(yù)測了特異性microRNA可能對靶基因發(fā)揮作用的通路,并應(yīng)用包括qRT-PCR、Western Blot實(shí)驗(yàn)輔以驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：高通量測序顯示uMSC-Exo豐度排名前十的miRNA分別為miR-21-5p、miR-125-5p、miR-23-3p、miR-100-5p、let-7f-5p、let-7a-5p、miR-145-5p、 miR-1260b、miR-1260a、miR-199a-3p。與現(xiàn)有的GEO數(shù)據(jù)作對照發(fā)現(xiàn)除了miR-21-5p,其余含量在uMSC細(xì)胞中本身比較少,這說明uMSC是一個(gè)主動(dòng)分泌miRNA的形式,而非被動(dòng)形式。隨后通過GO、Pathway對靶基因及通路的預(yù)測,發(fā)現(xiàn)其中miR-21-5p、 miR-125-5p、miR-23-3p、miR-145-5p都靶向了對肌成纖維細(xì)胞生成有重要作用的SMAD2、TGFβ2以及TGFβR2而且調(diào)控了TGFβ2/SMAD2這一信息通路。第五部分臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體中miRNA對肌成纖維細(xì)胞分化的機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)方法：首先我們通過構(gòu)建的TGFβ2, TGFβR2以及SMAD2的3'UTR的質(zhì)粒與預(yù)測得到并挑選出來的miR-21-5p、miR-125-5p、miR-23-3p、miR-145-5p的過表達(dá)mimics進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因。并通過qRT-PCR、Western Blot檢測在uMSC-Exo中過表達(dá)或抑制特異性miRNAs后,下游的靶基因αSMA以及通路中β-SMAD2的磷酸化活性：最后在動(dòng)物模型上通過熒光原位雜交技術(shù)定位uMSC-Exo中miR-21-5p、 miR-125-5p、miR-23-3p、miR-145-5p的分布情況以及其對p-SMAD2的活化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：雙熒光素酶報(bào)告基因顯示miR-21-5p、miR-125-5p、miR-23-3p、 miR-145-5p都可以直接與TGFβ2, TGFβR2或SMAD2的3'UTR端相結(jié)合,說明miRNAs可以直接這些蛋白的翻譯水平。qRT-PCR以及Western Blot顯示過表達(dá)miRNAs后,SMAD2, αSMA的表達(dá)量均發(fā)生下調(diào)；而抑制這些miRNAs后,靶基因則與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這些說明miR-21-5p、miR-125-5p、miR-23-3p、miR-145-5p可以通過抑制TGFβ2,TGFβR2以及SMAD2引起αSMA的下調(diào)。體內(nèi)原位雜交實(shí)驗(yàn)證明uMSCs-Exo在注射入創(chuàng)面四周皮下后,miRNA主要分布于皮下細(xì)胞的胞核周圍,并且可以抑制p-SMAD2的活性從而導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞分化減少。但對創(chuàng)面的愈合速度不受影響。
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第二軍醫(yī)大學(xué)博擊學(xué)位論文邐逡逑Ｊ．邋－邋－邋：－ｕ逡逑巧屒母：－’．ａ－兮＇＇掙：處淲逡逑＇－＂５＊己種，＇３思衛(wèi)－ｙ＇＇３－＾＾．＇－邋■邐－邋－邋－逡逑：方：——－－－邊逡逑：：ｍ逡逑畫．－：塌逡逑嫐－ｒ＇－＿邋．邋—邐－逡逑圖＾１低倍顯微鏡下間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察逡逑２、經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)的第４代人胳血間充質(zhì)干細(xì)胞均一表達(dá)逡逑Ｃｍ９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６，陽性率分別為邋９９．７％、９４．７％、９１．８％、９０．８％，而逡逑ＣＤ４５呈陰性，陽性率為０．１％邋（圖１－２）。說明組織貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)可得到較純凈的逡逑脈帶間充質(zhì)干細(xì)胞。逡逑＿０３－８ＬＡＮｔｅ00ｌ邐邋Ｔｕｂ。：邋ＢＬＡＮＫ－００１逡逑

２、經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)的第４代人胳血間充質(zhì)干細(xì)胞均一表達(dá)逡逑Ｃｍ９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６，陽性率分別為邋９９．７％、９４．７％、９１．８％、９０．８％，，而逡逑ＣＤ４５呈陰性，陽性率為０．１％邋（圖１－２）。說明組織貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)可得到較純凈的逡逑脈帶間充質(zhì)干細(xì)胞。逡逑＿０３－８ＬＡＮｔｅ00ｌ邐邋Ｔｕｂ。：邋ＢＬＡＮＫ－００１逡逑＾邐Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ邐＾Ｅｖｅｎｔｓ邐％Ｐａｒｅｎｔ邐％Ｔｏｔａ（逡逑２＂Ｖｊ邋Ｑ＾邋Ｑ３邐ｉｐ邋Ａｌｌ邋Ｅｖｅｎｔｓ邐１０．０００邐＃＃＃＃邐１０Ｏ邋Ｏ逡逑？邐■b6１邐９．５２７邐９５邋３邐９５．３逡逑Ｓ＂ｓ￣！邐邐邋■邋Ｐ２邐９．３７９邐９８．４邐９３．８逡逑＾邐０４邐Ｉ邋V簀澹眩卞危襄危埃板危埃板義希掊澹眩插危沖危埃板危埃板義希掊濉觶浚�？∮z傘ｅ危保掊蜼簀澹眩沖危梗桑村危梗梗峰危梗沖澹靛義稀澹茫模椋矗疲潁潁蓿鈴危桑懾危錠簀澹眩村危掊危板澹插危埃插義希埃常攏蹋粒危隋危埃埃插危裕酰�。：邋n蹋粒桑停耍擼埃埃插義希掊危校錚穡酰歟幔簦椋錚鑠危蓿牛觶澹睿簦簀危蓿校幔潁澹睿翦危ィ裕錚簦幔戾義希蓿В鄭赍危蓿插危齲殄澹粒歟戾澹牛觶澹睿簦簀危保埃埃埃板危＃＃＃ｅ危保埃埃板義峽紓斜馘巍靄灣危福保擔(dān)峰危澹殄錘B邐Ｍ邋６逡逑Ｓ邋ｇ－ｉ邋媜節(jié)＾邐邋■！戶２邐７．７２１邐９４邋７邐７７邋２逡逑ｗ邋；起本。３邐０４邐V簀澹眩卞危擔(dān)罰梗稿危罰靛澹卞危叮稿澹板義掀喝縉蜼螅眩插危玻常峰危常卞危玻村義現(xiàn)殖藻澹懾澹桑ⅲ�。＇∮zⅰ

本文編號(hào)：2538422