【摘要】：目的： 脂肪干細(xì)胞(Adipose-derived stem cells, ADSCs)作為細(xì)胞移植治療心肌梗死的種子細(xì)胞,具有易于獲取,數(shù)量豐富,多向分化等特點(diǎn)。將ADSCs移植用于治療心肌梗死已取得顯著的療效。然而,心肌梗死微環(huán)境復(fù)雜惡劣,不利于ADSCs的定植,進(jìn)而限制了ADSCs的治療效果。近年來,人們發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境下培養(yǎng)干細(xì)胞可作為提高ADSCs抗凋亡能力,增強(qiáng)ADSCs旁分泌效應(yīng)的體外預(yù)處理方法。本實(shí)驗(yàn)選取人脂肪干細(xì)胞(Human Adipose-derived stem cells, hADSCs),通過低氧環(huán)境下培養(yǎng)的方法,觀察其分泌的細(xì)胞因子與抗凋亡能力。同時(shí),選取中華小型豬,通過外科手術(shù)建立急性心肌梗死模型,將hADSCs與低氧環(huán)境下培養(yǎng)的人脂肪干細(xì)胞(Hypoxic Preconditioning human Adipose-derived stem cells, HP-hADSCs)經(jīng)心外膜移植至心肌梗死組織周圍,觀察hADSCs與HP-hADSCs移植對(duì)心肌梗死的修復(fù)效果并比對(duì)兩者之間的差異,從而進(jìn)一步探討可能存在的機(jī)制。方法： 經(jīng)吸脂術(shù)獲取脂肪組織后,hADSCs經(jīng)體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增至第3-5代。按照不同氧濃度環(huán)境分為5組：A：1%O2組,B：3%O2組,C：5%02組,D：10%02組,E：21%02組。各組hADSCs在各自培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)24小時(shí),應(yīng)用FCSA、RT-qPCR,ELISA、Western Blot、Annexin V-FITC/PI的方法對(duì)各組hADSCs的免疫細(xì)胞表型、細(xì)胞因子的基因表達(dá)與蛋白分泌、細(xì)胞的抗凋亡能力進(jìn)行對(duì)比,選出生物學(xué)特性最佳的hADSCs作為HP-hADSCs.采用外科手術(shù)方法于冠狀動(dòng)脈前降支中、遠(yuǎn)端1/3交界處結(jié)扎,制作豬急性心肌梗死動(dòng)物模型。隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為3組,每組8只,按以下條件分組：A組：對(duì)照組,心梗周圍組織注射0.9%氯化鈉,B組：hADSCs移植組,C組：HP-hADSCs移植組。A組注射劑量為1ml,B組與C組每只動(dòng)物分別經(jīng)心外膜注射1x108的hADSCs或HP-hADSCs,分成8-10個(gè)點(diǎn)注射至心梗周圍組織。術(shù)前、術(shù)后即刻,術(shù)后6周,采用靜息核素心肌灌注顯像與經(jīng)胸心動(dòng)超聲對(duì)心肌血流灌注和心功能做出評(píng)估。對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物施行安樂死后,采集梗死區(qū)域的心肌標(biāo)本,應(yīng)用HE染色、Massson染色、免疫熒光染色和TUNEL染色的方法觀察植入干細(xì)胞的定植、擴(kuò)增、血管新生、細(xì)胞凋亡。 結(jié)果： (1) hADSCs免疫表型抗原CD71、CD73、CD90、CD105陽性表達(dá),CD34、CD45、CD54. HLA-DR陰性表達(dá)。RT-qPCR示HGF與VEGF的mRNA表達(dá)量隨著氧濃度的降低而逐漸升高,以A組最為顯著(P0.05),而NGF與KGF的mRNA表達(dá)量并無顯著變化(P0.05)。ELISA結(jié)果提示低氧條件下培養(yǎng)hADSCs的細(xì)胞因子VEGF、HGF蛋白分泌量顯著增加,其中B組的HGF分泌量達(dá)2613.33±180.37ng/L,B組的VEGF分泌量達(dá)2856.08±114.63ng/L,顯著高于E組(HGF:2613.33＋180.37ng/L vs1733-.33＋102.63ng/L, P0.01; VEGF:2856.08±114.63ng/L vs2067.26±45.63ng/L,P0.01),各組hADSCs的細(xì)胞因子KGF與NGF蛋白分泌量并無顯著性差異(P0.05)。 (2) RT-qPCR示與其他組相比,A組中Bax. BNip3的mRNA表達(dá)量最高,B組中,Bcl-2的mRNA表達(dá)量最高。Western Blot示A組中hADSCs的HIF-la, Bax和BNip3蛋白表達(dá)水平最高,在B組中hADSCs的Bcl-2蛋白表達(dá)水平較高。將各組hADSCs放入無氧無血清低糖培養(yǎng)環(huán)境中12小時(shí),Annexin V FITC/PI示A組、B組、C組hADSCs在此環(huán)境中的存活率較高,雖三組間比較并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但以B組中ADSCs的存活率最高。結(jié)合各組hADSCs的細(xì)胞因子蛋白分泌量結(jié)果,3%02環(huán)境適宜培養(yǎng)hADSCs,因此,擬將此環(huán)境中培養(yǎng)的hADSCs作為HP-hADSCs進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。 (3)干細(xì)胞移植6周后,hADSCs移植組與HP-hADSCs移植組經(jīng)靜息核素心肌灌注顯像檢測(cè)的灌注質(zhì)量缺損百分率變化得到改善,以HP-hADSCs移植組更為顯著(P0.01)；經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖觀察到的各組LVEF與IWT并無顯著差異(P0.05),但HP-hADSCs組中的LVEDV與LVESV得到顯著改善(P0.05)。HE染色與Masson染色示hADSCs移植組與HP-hADSCs移植組纖維化程度較低,兩組間雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但HP-hADSCs移植組纖維化降低程度的趨勢(shì)更為明顯。 (4)免疫熒光檢查發(fā)現(xiàn),干細(xì)胞移植6周后,HP-hADSCs移植組中Ki67與β-microglobulin陽性表達(dá),說明HP-hADSCs仍存活于心肌梗死周圍,且呈擴(kuò)增狀態(tài),而hADSCs移植組僅發(fā)現(xiàn)移植的細(xì)胞。與對(duì)照組相比,HP-hADSCs移植組與hADSCs移植組的IsolactinB4陽性表達(dá),且HP-hADSCs移植組中可見清晰的血管組織走形。TUNEL染色示HP-hADSCs移植組與hADSCs移植組中的細(xì)胞凋亡明顯減少,以HP-hADSCs移植組更為顯著(P0.01)。 結(jié)論： (1)低氧環(huán)境下培養(yǎng)是提高h(yuǎn)ADSCs旁分泌及抗凋亡能力的有效方法,但過低的氧濃度(023%)不易于hADSCs的生存。 (2)3%02環(huán)境中培養(yǎng)hADSCs24小時(shí),可有效提高ADSCs細(xì)胞因子分泌量以及抗凋亡能力。 (3)與hADSCs移植相比,經(jīng)心外膜注射HP-hADSCs夠縮小心肌梗死面積,減少心肌纖維化,使心功能不再惡化,有效抑制心室重塑。 (4) HP-hADSCs能夠在心肌組織中存活擴(kuò)增,通過旁分泌途徑促進(jìn)血管新生,減少細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R542.22

【參考文獻(xiàn)】

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1 宋華培;黃躍生;黨永明;張東霞;褚志剛;張瓊;;PI3K/Akt信號(hào)途徑抑制燒傷后大鼠缺血缺氧心肌細(xì)胞凋亡[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年01期

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本文編號(hào)：2523886