【摘要】：第一部分DCPIB減弱氧糖剝奪誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞增殖及促炎因子的分泌 目的：研究氧糖剝奪后DCPIB對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖及促炎癥因子分泌的影響 方法：采用中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心購(gòu)買(mǎi)的小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2細(xì)胞系,將凍存BV-2細(xì)胞系經(jīng)過(guò)復(fù)蘇后種植于多聚賴(lài)氨酸包被的24孔塑料培養(yǎng)板中,隨機(jī)將小膠質(zhì)細(xì)胞分組為對(duì)照組、OGD組及OGD+DCPIB組,然后將OGD組及OGD+DCPIB組培養(yǎng)基更換為無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基,同時(shí)OGD+DCPIB組給予DCPIB(10μM),置于2%O2的缺氧培養(yǎng)箱l0min后,更換為高糖及無(wú)血清培養(yǎng)基并置于37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)箱3h,然后應(yīng)用免疫熒光技術(shù)將小膠質(zhì)細(xì)胞固定、破膜、封閉、加一抗OX-42與Ki67、TNF-α、IL-Iβ三種分別雙染,過(guò)夜與4℃冰箱,并次日分別均加三組雙染的一抗用二抗CY3及FITC標(biāo)記的IgG雙染,并避光熒光顯微鏡拍照。計(jì)算小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞Ki67、TNF-α及IL-I β陽(yáng)性率。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果：小膠質(zhì)細(xì)胞的Ki67陽(yáng)性表達(dá)于胞核上；與對(duì)照組相比,OGD組OX-42陽(yáng)性的小膠質(zhì)細(xì)胞Ki67表達(dá)明顯升高(P0.01,n=6)：而在OGD+DCPIB組OX-42陽(yáng)性的小膠質(zhì)細(xì)胞的Ki67表達(dá)則較之OGD組明顯下降(P0.01,n=6)。與對(duì)照組相比,10minOGD組小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α、IL-Iβ表達(dá)百分率明顯升高；而在OGD+DCPIB組小膠質(zhì)細(xì)胞的TNF-α、IL-Iβ表達(dá)則較之OGD組明顯下降。 結(jié)論短暫的氧糖剝奪可以增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化及增殖,而在氧糖剝奪前給予DCPIB干預(yù)可以減弱小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖能力,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞分泌上述兩種炎癥因子。 第二部分DCPIB抑制氧糖剝奪引起的小膠質(zhì)細(xì)胞遷移 目的研究氧糖剝奪后DCPIB對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移的影響 方法小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2細(xì)胞系種植于6孔塑料培養(yǎng)板中待細(xì)胞匯集度達(dá)到80%時(shí),隨機(jī)將小膠質(zhì)細(xì)胞分組為對(duì)照組、OGD組及OGD+DCPIB組,用無(wú)菌注射器頭按相同的坐標(biāo)位置劃痕小膠質(zhì)細(xì)胞形成空白劃痕,對(duì)照組培養(yǎng)基為無(wú)血清高糖培養(yǎng)基37℃、5%C02常規(guī)培養(yǎng)箱,同時(shí)將OGD組及OGD+DCPIB組培養(yǎng)基更換為無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基,同時(shí)OGD+DCPIB組給予DCPIB(10uM),置于2%02的缺氧培養(yǎng)箱10min后,更換為高糖及無(wú)血清培養(yǎng)基并置于37℃、5%C02常規(guī)培養(yǎng)箱48h,然后應(yīng)用倒置相差顯微鏡拍攝小膠質(zhì)細(xì)胞遷移的面積。NIH Image J軟件計(jì)算OGD后3,6,12,24,和48h劃痕造成的空白面積,運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果：劃痕48h后,OGD組小膠質(zhì)細(xì)胞劃痕空白的面積較之空白對(duì)照組明顯縮小(P0.01,n=6)；而在OGD+DCPIB組,則較之OGD組劃痕空白的面積明顯大(P0.O1,n=6)。 結(jié)論短暫的氧糖剝奪可以導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞遷移能力增強(qiáng),而在氧糖剝奪前給予DCPIB干預(yù)可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移能力。 第三部分DCPIB抑制離體及活體狀態(tài)下缺血再灌注后小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷 目的研究離體及活體狀態(tài)下DCPIB對(duì)缺血條件下神經(jīng)元的保護(hù)作用 方法采用上述BV-2細(xì)胞系種植于Transwell、室,而將取自小鼠海馬的原代神經(jīng)元培養(yǎng)于24孔塑料培養(yǎng)板7d后,將小膠質(zhì)細(xì)胞/神經(jīng)元共培養(yǎng)體隨機(jī)分組為對(duì)照組、OGD組及OGD+DCPIB組,然后將OGD組及OGD+DCPIB組Transwell小室的上層培養(yǎng)基更換為無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基,同時(shí)OGD+DCPIB組于小室上層培養(yǎng)基中給予DCPIB(10uM),置于2%O2的缺氧培養(yǎng)箱l0min后,OGD組及OGD+DCPIB組Transwell小室的上層培養(yǎng)基更換為高糖及無(wú)血清培養(yǎng)基并置于37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)箱3h。同樣在SD大鼠分為對(duì)照組、rMCAO組及rMCAO+DCPIB組(250g,n=5),將頸內(nèi)動(dòng)脈栓塞1h后,拔除栓子再灌注3d形成rMCAO模型,而rMCAO前腦室內(nèi)給予10u1的DCPIB (1mM)后,再形成rMACO模型,為rMCAO+DCPIB組。免疫熒光染色神經(jīng)元。計(jì)算神經(jīng)元在離體及活體情況下各組存活陽(yáng)性率,運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果與對(duì)照組相比,10minOGD組神經(jīng)元NeuN陽(yáng)性表達(dá)明顯下降(P0.01,n=6),而在OGD+DCPIB組神經(jīng)元NeuN陽(yáng)性表達(dá)則較之OGD組明顯增高(P0.01,n=6)；活體rMCAO'情況下,大鼠海馬區(qū)CA1神經(jīng)元死亡較對(duì)照組多,而在rMCAO+DCPIB組神經(jīng)元存活率高于rMCAO組。 結(jié)論DCPIB可以抑制活體和離體狀態(tài)下缺血再灌注后小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)元的死亡 第四部分DCPIB通過(guò)MAPK通路抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化 目的研究DCPIB對(duì)脂多糖或氧糖剝奪誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化通路的影響 方法將小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2細(xì)胞系種植于玻璃培養(yǎng)瓶中,隨機(jī)將小膠質(zhì)細(xì)胞分組為對(duì)照組、LPS組及LPS+DCPIB、LPS+PD98059組、LPS+SB203580組.PS+SP600125組(n=4),然后將LPS組及LPS+DCPIB組培養(yǎng)基更換高糖無(wú)血清培養(yǎng)基并加LPS(10μg/ml)后培養(yǎng)2h前,同時(shí)將LPS+DCPIB組、LPS+PD98059組、LPS+SB203580組及LPS+SP600125組分別給予DCPIB、PD98059、SB203580及SP600125(10uM),各組收集小膠質(zhì)細(xì)胞并提取總蛋白,利用Western blot獲取各組p-ERK1/2、p-JNK及p-p38表達(dá)；同樣,將小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2細(xì)胞系種植培養(yǎng)瓶中,隨機(jī)將小膠質(zhì)細(xì)胞分組為對(duì)照組、OGD組及OGD+DCPIB組,然后將OGD組及GD+DCPIB組培養(yǎng)基更換無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基后置于2%O2的缺氧培養(yǎng)箱l0min后,然后分別更換為高糖及無(wú)血清培養(yǎng)基并置于37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)箱培養(yǎng),在常規(guī)培養(yǎng)箱培養(yǎng)0、0.5h、1h、3h及6h后,以上述Western blot,各組收集小膠質(zhì)細(xì)胞并提取總蛋白,獲取各組不同時(shí)間點(diǎn)p-ERK1/2、p-JNM及p-p38蛋白表達(dá)。將各組表達(dá)的不同激酶p-ERK1/2、p-JNK及p-p38經(jīng)暗室曝光,運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件半定量分析,SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果與對(duì)照組相比,LPS組小膠質(zhì)細(xì)胞的MAPK通路三個(gè)激酶p-ERK1/2、p-JNK及p-p38表達(dá)明顯升高(PO.01,n=4)；而LPS+DCPIB組與LPS組比較,p-ERK1/2、p-JNK及p-p38表達(dá)則明顯下降(P0.05,n=4)；而LPS+PD98059組較LPS組小膠質(zhì)細(xì)胞的p-ERK1/2表達(dá)明顯下降(P0.05,n=4),LPS+SB203580組較LPS組小膠質(zhì)細(xì)胞的p-p38表達(dá)亦明顯下降(P0.05,n=4),PS+SP600125組較LPS組小膠質(zhì)細(xì)胞的p-JNK表達(dá)同樣明顯下降(P0.05,n=4)；而OGD后小膠質(zhì)細(xì)胞的p-ERK1/2、p-JNK及p-p38分別在OGD后30、15和30mmin表達(dá)明顯升高至最高峰(P0.05,n=6),而OGD+DCPIB組p-ERK1/2、p-JNK及p-p38較OGD組表達(dá)明顯下降(P0.05,n=6)。 結(jié)論DCPIB通過(guò)MAPKs信號(hào)通路對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化抑制。
【圖文】：

圖1小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2的0X42 (CDllb)和Ki67的表達(dá)。（A)對(duì)照組組BV2 (A1 - 2),OGD (B1, lOmin)和 OGD+DCPIB (CI, 10 Ji M)。BV2 特異性抗體 OX-42 (紅色)? Al,B1和CI分別代表上述不同條件下核蛋白Ki67的表達(dá)。A2、B2和C2是0X-42(紅色）、Ki-67 (綠色）和DAPI (藍(lán)色）三者的合成圖片.一過(guò)性氧糖剝奪導(dǎo)致了Ki67的表達(dá)升高(B1-2)，，而這一效應(yīng)被DCPIB抑制（C1-2). (D) Ki-67染色陽(yáng)性的 BV-2 細(xì)胞定量分析。**p〈0.01, OGD vs 對(duì)照組；p〈0. 01, DCPIB vs OGD 組(n=6)o

圖2 DCPIB對(duì)氧糖剝奪誘導(dǎo)的BV2分泌的炎癥性因子(TNF-a和IL-l)影在對(duì)照組條件下的的TNF-a的表達(dá)1(A1 -2)，10 min 一過(guò)性氧糖(A3-4)OGD+10 IX M DCPIB (A5-B)后再灌注 3 h。A2, A4 和 A6 是 T色)/DAPI (藍(lán)色）染色的合成圖片。B. BV2在對(duì)照組條件下的的IL-e的-2)，10 min 一過(guò)性氧糖剝奪 OGD (B3-4)或者 0GD+10 u M DCPIB (B5 - 注3 ho B2, B4和B6是IL-e (綠色)/DAPI (藍(lán)色）染色的合成圖片。剝奪后TNF-a和IL-le表達(dá)均明顯增加(A4和B4)。VRACs通道阻滯劑D了這種病理性改變(A6和B6)。34
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R651.15

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2522716