【摘要】：缺血再灌注(Ischemia Reperfusion, I/R)指器官或組織在血供中斷或受限后重新恢復(fù)血供的病理過程。缺血的組織／器官在血供恢復(fù)、缺氧解除后,表現(xiàn)出較缺血階段更劇烈的炎癥反應(yīng)和組織／器官損傷,稱為缺血再灌注損傷(Ischemia and Reperfusion Injury,IRI)。骨骼肌缺血再灌注損傷見于創(chuàng)傷、外科手術(shù)及其它疾病,肢體／軀干部位擠壓傷可以導(dǎo)致嚴(yán)重的骨骼肌缺血再灌注損傷,甚至還會(huì)引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征、急性肺損傷甚至多器官功能衰竭。負(fù)壓封閉引流(Vacuum Sealing Drainage, VSD)廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷等各外科領(lǐng)域,可以減輕局部創(chuàng)傷組織水腫和炎癥反應(yīng),增加組織血流灌注,并可降低全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官衰竭的發(fā)生率。本研究論文擬通過臨床觀察,分析合并血管損傷的下肢開放性骨折病人使用VSD治療的效果及安全性：并通過試驗(yàn)研究探討VSD減輕骨骼肌缺血再灌注損傷及其相關(guān)肺損傷的作用機(jī)制。1.臨床研究目的臨床研究部分主要觀察負(fù)壓封閉引流治療下肢擠壓伴開放性骨折合并血管損傷病人的安全性和臨床療效。方法搜集我院創(chuàng)傷外科2014年1月至2015年12月所有合并血管損傷的嚴(yán)重下肢開放性骨折病人的病例資料,按照急診術(shù)后是否以VSD覆蓋創(chuàng)口分為VSD治療組及非VSD治療組,比較兩組病人急診術(shù)前肢體缺血時(shí)間、截肢評(píng)分、急診術(shù)后血管痙攣、栓塞、出血等并發(fā)癥例數(shù),再次血管探查,創(chuàng)口感染,急性肺損傷,截肢例數(shù),創(chuàng)口閉合時(shí)間和植皮／皮瓣例數(shù),以及血清CRP、IL-6和肌紅蛋白濃度,分析負(fù)壓封閉引流對(duì)該類病人的治療效果。結(jié)果兩組病人急診術(shù)前的缺血時(shí)間,截肢評(píng)分,血清CRP,IL-6和肌紅蛋白以及術(shù)后血管痙攣、栓塞、出血等并發(fā)癥發(fā)生率比較無差異；VSD治療組急診術(shù)后再次血管探查手術(shù)率,創(chuàng)口感染率,急性肺損傷發(fā)生率均低于非VSD治療組：VSD治療組傷后創(chuàng)口閉合時(shí)間也少于非VSD治療組且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；在治療72小時(shí)后,VSD組患者血清CRP,IL-6以及肌紅蛋白水平均低于非VSD治療組,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P0.05)。結(jié)論負(fù)壓封閉引流治療并發(fā)血管損傷的下肢開放性骨折創(chuàng)口,并不增加吻合血管痙攣、栓塞及出血的發(fā)生率,且可以減少創(chuàng)口閉合時(shí)間,促進(jìn)創(chuàng)口愈合,減輕全身炎癥反應(yīng),但負(fù)壓封閉引流是否能減輕骨骼肌缺血再灌注損傷,還有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究的驗(yàn)證。2.實(shí)驗(yàn)研究目的研究負(fù)壓封閉引流減輕肢體骨骼肌缺血再灌注損傷及其相關(guān)肺損傷的機(jī)制。方法試驗(yàn)研究部分選用雄性Sprague Dawley大鼠建立后肢骨骼肌缺血再灌注損傷動(dòng)物模型,通過夾閉和開放股動(dòng)脈實(shí)現(xiàn)大鼠左后肢缺血4小時(shí)、再灌注8小時(shí)。試驗(yàn)動(dòng)物分為假手術(shù)對(duì)照組,缺血/再灌注(I/R)損傷模型組,負(fù)壓封閉引流干預(yù)的缺血/再灌注損傷模型組(I/R+VSD組),每組12只。各實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取6只大鼠,利用伊文思藍(lán)法測(cè)定肺毛細(xì)血管滲漏情況。各組其余模型用于以下檢測(cè)：①檢測(cè)大鼠左后肢腓腸肌組織氧分壓：②測(cè)定骨骼肌和肺組織的濕重/干重比；③骨骼肌細(xì)胞活性MTT法測(cè)定：④骨骼肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)(SOD、MDA、CAT、GSH)濃度的測(cè)定；⑤骨骼肌MPO濃度測(cè)定：⑥骨骼肌血管內(nèi)皮生長因子測(cè)定；⑦骨骼肌、肺和血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α濃度測(cè)定：⑧骨骼肌和肺組織病理學(xué)評(píng)估分別采用HE染色,骨骼肌組織]HMGB1蛋白免疫組化染色以及Tunel法制片,用于觀察組織形態(tài)、HMGB1蛋白表達(dá)(定性)和定位、細(xì)胞凋亡情況等;⑨在基因水平(aRNA)和蛋白水平分別檢測(cè)骨骼肌、肺、血清中炎癥相關(guān)蛋白HMGB1表達(dá)的情況。所有數(shù)據(jù)用SPSS 19軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式進(jìn)行表述,統(tǒng)計(jì)分析前先驗(yàn)證數(shù)據(jù)正態(tài)性及方差齊性,三個(gè)試驗(yàn)組組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較用LSD法(方差齊)或Tamhane's T2法(方差不齊),氧分壓數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析,P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果①伊文思藍(lán)測(cè)定VSD組大鼠肺毛細(xì)血管滲漏程度低于I/R組(t=5.289 P0.001),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②缺血再灌注后使用VSD組干預(yù)組大鼠的骨骼肌組織氧分壓在再灌注初期顯著低于I/R組(P0.05),且再灌注后氧分壓穩(wěn)定在較低水平,有利于抑制需要氧分子參與的氧化應(yīng)激反應(yīng)。③VSD組大鼠骨骼肌和肺部組織的濕重／干重比顯著低于1[R組(t=7.718 P0.001；t=4.427 P0.001),說明VSD組大鼠骨骼肌和肺組織水腫程度低于I/R組。④MTT結(jié)果顯示VSD骨骼肌細(xì)胞的活性顯著高于I/R組(t=3.059 P=0.006)。⑤氧化應(yīng)激時(shí)組織過氧化損傷產(chǎn)物MDA在VSD組的濃度水平顯著低于I/R組(t=2.212 P=0.043),而VSD組的抗氧化因子SOD、CAT和GSH的水平明顯高于I/R組,差異顯著(t=2.492 P=0.025；t=2.264 P=0.039;t=2.424 P=0.028)。⑥炎癥指標(biāo)MPO在VSD組的濃度低于I/R組,差值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.145 P=0.049)。⑦VEGF在I/R組和VSD組的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增高(F=77.616 P0.001),且VSD組升高程度顯著大于I/R組(t=7.459 P0.001)。⑧炎癥因子IL-1p、IL-6、TNF-a濃度水平的顯著差異表現(xiàn)為VSD組低于I/R組(P0.05)。⑨骨骼肌HE染色切片顯示VSD組組織細(xì)胞間隙比例與排列情況接近正常組織,而I/R組骨骼肌細(xì)胞表現(xiàn)為肌纖維變性,肌細(xì)胞間隙增寬,炎癥細(xì)胞浸潤,兩組骨骼肌損傷評(píng)分差異顯著(t=6.198 P0.001)：肺組織HE切片則表現(xiàn)為VSD組的炎癥細(xì)胞浸潤、水腫和滲出的程度低于I/R組,兩組肺部損傷評(píng)分差異顯著(t=6.033 P0.001)；免疫組化結(jié)果顯示,損傷相關(guān)蛋白HMGB1在VSD組骨骼肌中的表達(dá)明顯低于I/R組：Tunel檢測(cè)結(jié)果表明骨骼肌缺血再灌注損傷后局部組織細(xì)胞發(fā)生了凋亡,而VSD的干預(yù)可明顯降低骨骼肌組織發(fā)生凋亡細(xì)胞的比例,表現(xiàn)為與/IR組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.177 P0.001)。⑩熒光定量PCR結(jié)果和免疫蛋白印跡Western Blot結(jié)果顯示,HBGB1在VSD組的骨骼肌和肺組織的基因表達(dá)水平、蛋白表達(dá)水平均低于I/R組,差異顯著(P0.05)；ELISA法測(cè)定血清HMGB1的結(jié)果也表現(xiàn)出相同的變化。結(jié)論持續(xù)負(fù)壓封閉引流,可以移除骨骼肌組織間隙內(nèi)多余的液體,減輕水腫,增加毛細(xì)血管血流灌注,負(fù)壓封閉引流降低了再灌注后骨骼肌組織的氧分壓和炎癥因子,減輕了氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的程度,繼而改善了缺血再灌注引起的骨骼肌組織水腫、肌纖維變形、壞死,肌細(xì)胞活性下降和細(xì)胞凋亡：負(fù)壓封閉引流減輕骨骼肌缺血再灌注損傷,降低血漿炎癥因子,移除可以導(dǎo)致急性肺損傷的損傷相關(guān)蛋白分子HMGB1蛋白,繼而減輕全身炎癥反應(yīng)和急性肺損傷。綜上,負(fù)壓封閉引流應(yīng)用于并發(fā)血管損傷的下肢開放性骨折病人,可以促進(jìn)創(chuàng)口愈合,減輕全身炎癥反應(yīng),一定程度減少創(chuàng)口感染和急性肺損傷的發(fā)生率,使病人受益。通過動(dòng)物試驗(yàn)可知,負(fù)壓封閉引流通過降低骨骼肌組織氧分壓,減輕骨骼肌氧化應(yīng)激損傷：通過減輕組織水腫,增加骨骼肌血流灌注,緩解骨骼肌缺血再灌注時(shí)的“無復(fù)流現(xiàn)象”;通過減輕骨骼肌炎癥反應(yīng),降低骨骼肌、血漿和肺部炎癥因子以及損傷相關(guān)蛋白HMGB1的含量,從而減輕下肢I(xiàn)RI引發(fā)的急性肺損傷。
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（ｐｉｃｔｉｖｅ邋ｄｒａｗｅｄ邋ｂｙ邋Ｃ邋Ｈｕａｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ邋２０１４）逡逑查閱文獻(xiàn)的過程中，我們還注意到了雖然負(fù)壓封閉引流在創(chuàng)傷骨科臨床在血管損傷修復(fù)術(shù)啟ＶＳＤ的使用還是一個(gè)存在爭議的問題，針對(duì)ＶＳＤ作用是否會(huì)增加血管痊李、血管栓塞或者導(dǎo)致吻合口破裂出血等，這些的答案ＩＷ。相關(guān)研巧既有用于血管移棺術(shù)后獲得良好收效的報(bào)道，又有Ｖ破裂大出血引起的致死并發(fā)癥的案例。逡逑于上化ＩＲＩ的損傷機(jī)制和ＶＳＤ治療ＩＲＩ己有的試驗(yàn)室報(bào)道。本研究擬開與討論：①回顧性分析我院創(chuàng)傷外科收治嚴(yán)重下肢開放性骨折合并血管用ＶＳＤ治療后的效果（臨岕究）；②通過動(dòng)物試驗(yàn)研究負(fù)勵(lì)閉引流冉灌注損傷及其引發(fā)的急性肺損傷保護(hù)性作用的機(jī)制。逡逑

．３．１濕重／干重比法評(píng)估組織水腫程度逡逑取適當(dāng)損傷部位的骨骼肌組織和肺部組織，分別稱取新鮮和烘干后的重量，可Ｗ逡逑獲得組織濕重／干重比，通過比較各組大鼠組織濕重／干重比，可平估缺血再灌注損傷逡逑后骨骼肌和肺姐織水腫的情況。由下圖Ａ可知，Ｉ／Ｒ組骨骼肌水腫程度氋于對(duì)照組和逡逑ＶＳＤ干預(yù)組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（／心％．６６７，尸＜０．００１）；而對(duì)照絕與ＶＳＤ組比較無明顯逡逑差異（片０．６４５，b6＝０．５％），說明ＶＳＤ可顯著改善損傷組織的水腫程度。通過圖Ｂ可知，逡逑Ｉ／Ｒ組肺水腫程度明顯高于對(duì)照組（戶１０．６０８，戶＜０．００１），，說明下肢骨骼肌缺血再灌注逡逑損傷后出現(xiàn)了急性肺水腫的表現(xiàn)；ＶＳＤ組大鼠肺水腫程度較Ｉ／Ｒ組顯著減輕（戶４．４２７，逡逑戶＜０．００１），但仍氋于對(duì)照組，說明ＶＳＤ在一定程度上緩解下肢缺血再灌注導(dǎo)致的急性逡逑肺損傷。逡逑
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R641


本文編號(hào)：2520846