【摘要】：創(chuàng)面愈合是十分復(fù)雜的過(guò)程，其中最為重要的是角質(zhì)細(xì)胞的遷移和成纖維細(xì)胞的移行，在愈合的過(guò)程中，角質(zhì)細(xì)胞通過(guò)松脫細(xì)胞與細(xì)胞，細(xì)胞與基質(zhì)之間的橋粒與半橋粒的連接，還有改變細(xì)胞運(yùn)動(dòng)蛋白等來(lái)配合細(xì)胞向創(chuàng)面中心移行。而這過(guò)程受生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子，趨化因子，抗菌肽，氧分壓以及金屬蛋白酶基質(zhì)等諸多因素的影響。大量實(shí)驗(yàn)證明創(chuàng)面形成后，因?yàn)閯?chuàng)面局部耗氧量增加以及血管網(wǎng)遭破壞，而導(dǎo)致創(chuàng)面局部形成低氧環(huán)境。創(chuàng)面低氧也成為創(chuàng)面形成后普遍存在的現(xiàn)象，因此聚焦了大量低氧環(huán)境對(duì)創(chuàng)面愈合的研究。低氧在創(chuàng)面愈合中不僅僅影響細(xì)胞代謝，低氧環(huán)境還可以調(diào)控生長(zhǎng)因子的生成，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖以及加快表皮細(xì)胞的移行。但是其具體分子機(jī)制不是十分明確。 MMPs是一組能夠水解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白裂解酶，MMP-9是其家族中的重要一員，又稱(chēng)Ⅳ型膠原酶或明膠酶。MMP-9合成后以酶原的形式從胞內(nèi)分泌到胞外。MMP-9參與了急性創(chuàng)面修復(fù)的一些早期步驟,包括角質(zhì)形成細(xì)胞從基底膜脫離,促進(jìn)細(xì)胞沿創(chuàng)面基質(zhì)爬行等。MMP-9表達(dá)升高可促進(jìn)上皮細(xì)胞的移行；反之，則抑制表皮細(xì)胞移行。低氧環(huán)境可以促進(jìn)MMP-9的表達(dá)，而其中低氧因素對(duì)表皮細(xì)胞表達(dá)MMP-9有促進(jìn)作用，而對(duì)成纖維細(xì)胞無(wú)明顯作用。 CD9是一種24kDa的細(xì)胞表面四次跨膜蛋白，該蛋白在血小板活化與凝聚，精卵融合，細(xì)胞移行和增殖等多方面均發(fā)揮作用。其中機(jī)制目前不完全清楚，我組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面形成后角質(zhì)形成細(xì)胞CD9表達(dá)下降，可能與細(xì)胞移行有關(guān)。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)體外實(shí)驗(yàn)中，單純低氧因素可以降低表皮細(xì)胞CD9的表達(dá)，卻使得成纖維細(xì)胞CD9表達(dá)升高。以往有研究發(fā)現(xiàn)在卵細(xì)胞中CD9可通過(guò)整合素β1提高細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性。但是，目前仍然沒(méi)有基礎(chǔ)研究創(chuàng)面中低氧如何通過(guò)調(diào)節(jié)CD9參與創(chuàng)面愈合的過(guò)程。 在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在低氧條件下，HaCaT細(xì)胞CD9表達(dá)下調(diào)，但是低氧未明顯促進(jìn)細(xì)胞移行，而在成纖維細(xì)胞中CD9表達(dá)升高，，可促進(jìn)其增殖，并在創(chuàng)面愈合過(guò)程中具有積極作用。 1.材料與方法 采用體外實(shí)驗(yàn)的方法。 比較常氧及低氧條件下表皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞移行及增殖的變化，遵循既有方法，原代培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞，應(yīng)用表皮細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞株。給予兩種細(xì)胞2%氧氣培養(yǎng)環(huán)境，應(yīng)用transwell及細(xì)胞劃痕觀(guān)察細(xì)胞移行，CCK-8及Brdu標(biāo)記法測(cè)定細(xì)胞增殖，于2%氧氣下培育24h后觀(guān)察兩種細(xì)胞的移行既增殖變化。以觀(guān)察低氧環(huán)境其對(duì)創(chuàng)面修復(fù)主要細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。 給予表皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞2%氧氣(93%N2，5%CO2,2%O2)作用12h，18h和24h后，檢測(cè)缺氧條件下，以Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CD9，MMP-9，p-AKT和p38蛋白表達(dá)量，同時(shí)應(yīng)用明膠酶譜測(cè)兩種細(xì)胞在低氧環(huán)境下胞外分泌MMP-9的。應(yīng)用real time PCR檢測(cè)低氧下HaCaT細(xì)胞MMP-9mRNA的表達(dá)。 2.主要結(jié)果與結(jié)論 2.1應(yīng)用Western blot檢測(cè)MMP-9蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)低氧3h組與低氧6h組中HaCaT細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)水平比常氧對(duì)照組顯著增加。而在成纖維細(xì)胞中，無(wú)論是常氧或是低氧培養(yǎng)條件，幾乎未檢測(cè)到MMP-9表達(dá)。 2.2而在明膠酶譜法檢測(cè)MMP-9的胞外分泌也發(fā)現(xiàn)HaCaT表皮細(xì)胞低氧6h組比常氧對(duì)照組顯著差異(P=0.001)。而成纖維細(xì)胞無(wú)論常氧還是在低氧培養(yǎng)下，其培養(yǎng)液中胞外分泌的MP-9的含量都極少。 2.3應(yīng)用Real time PCR檢測(cè)MMP-9mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)低氧培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞6h后，HaCaT細(xì)胞MMP-9mRNA水平較常氧對(duì)照組明顯增高。提示低氧環(huán)境從翻譯水平上調(diào)控表皮細(xì)胞MMP-9的表達(dá)。 2.4應(yīng)用2%氧含量模擬創(chuàng)面缺氧環(huán)境，對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行低氧培養(yǎng)，應(yīng)用CCK-8及Brdu增殖細(xì)胞免疫染色檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示低氧組(H)較常氧對(duì)照組(Con)增殖快(P0.05)。 2.5我們?cè)诘脱醐h(huán)境下培養(yǎng)表皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，分12h、18h及24h觀(guān)察CD9蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示成纖維細(xì)胞缺氧組(H)較常氧對(duì)照組(Con)CD9蛋白表達(dá)明顯增高(P0.05)。而表皮細(xì)胞缺氧組(H)較常氧對(duì)照組(Con)CD9蛋白表達(dá)明顯降低(P0.05)。 2.6我們應(yīng)用高表達(dá)CD9腺病毒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞72h后，應(yīng)用western blot檢測(cè)細(xì)胞CD9的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)55kd(即CD9與GFP融合蛋白)處高表達(dá)轉(zhuǎn)染組較空載組表達(dá)增加，而25kd處無(wú)明顯變化，說(shuō)明瞬時(shí)轉(zhuǎn)染成功。同時(shí)應(yīng)用CCK8的方法檢測(cè)成纖維細(xì)胞的增殖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CD9高表達(dá)組較空載對(duì)照組明顯升高(P0.05)，提示CD9高表達(dá)可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖。 2.7通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞中p-Akt及p38進(jìn)行western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CD9高表達(dá)后p-Akt及p38較正常對(duì)照組(Con)以及空載對(duì)照組明顯升高(P0.05)，提示AKT或者p38途徑可能參與CD9高表達(dá)后細(xì)胞增殖過(guò)程，但是具體機(jī)制有待進(jìn)一步證明與深入研究。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R641

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本文編號(hào)：2515138