【摘要】：一、前言跟腱是小腿腓腸肌內(nèi)外側(cè)頭和比目魚(yú)肌肌腱于足跟上方約15cm處融合而成,是人體中最粗大的肌腱,其上半部分為圓形,下半部分為扁平狀,質(zhì)地堅(jiān)韌,色澤光亮呈白色。跟腱內(nèi)纖維束為90。螺旋交叉排列,其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)有助于跟腱的延長(zhǎng)和在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中能量的吸收和緩沖。跟腱不同于其他肌腱組織,其無(wú)明顯的腱鞘,僅由兩層腱膜組織包裹,并且血供相對(duì)較差,在跟腱的止點(diǎn)位置尤甚。跟腱主要功能是傳遞小腿三頭肌的足跖屈力量,跟腱的正常功能對(duì)維持人正常站立及行走運(yùn)動(dòng)發(fā)揮著極其重要的作用。伴隨著人民生活水平的提高和全民健身意識(shí)的普及,跟腱損傷及病變成為了臨床工作中的多發(fā)常見(jiàn)病,跟腱病變常常導(dǎo)致嚴(yán)重的足踝部疼痛和活動(dòng)受限,并伴有跟腱內(nèi)影像學(xué)的異常改變。跟腱病變不僅在從事高強(qiáng)度體能訓(xùn)練的專(zhuān)業(yè)運(yùn)動(dòng)員人群中有較高的發(fā)病率,而且在運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度適度的普通人群中仍具有一定發(fā)病率。合并臨床癥狀的跟腱病變一旦發(fā)生,常常會(huì)對(duì)患者的運(yùn)動(dòng)功能造成極其不利的影響,常需要較長(zhǎng)的恢復(fù)時(shí)間,更嚴(yán)重的是跟腱病變往往導(dǎo)致跟腱生物力學(xué)的性能的改變,如跟腱抗拉伸及抗疲勞能力下降等,使得跟腱無(wú)法滿(mǎn)足并適應(yīng)高負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)需要。在從事劇烈運(yùn)動(dòng)負(fù)荷時(shí),最終導(dǎo)致跟腱的斷裂和足跖屈功能的完全丟失。而上述結(jié)果對(duì)于專(zhuān)業(yè)運(yùn)動(dòng)員的職業(yè)運(yùn)動(dòng)生涯通常是嚴(yán)重的打擊。因跟腱斷裂而中斷職業(yè)生涯的運(yùn)動(dòng)員屢見(jiàn)不鮮,因此跟腱病變發(fā)病機(jī)制及其防治措施是目前運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。但目前對(duì)于跟腱病的潛在病理變化過(guò)程及其病理生理機(jī)制尚不清楚,因此使其治療的發(fā)展受到了嚴(yán)重制約。在既往的認(rèn)識(shí)中,由于跟腱病變常伴有跟腱局部腫脹和疼痛,且甾體類(lèi)抗炎藥物可在一定程度上緩解跟腱病的臨床癥狀,故將其發(fā)病的原因歸結(jié)于原發(fā)性炎癥的介導(dǎo),因此跟腱病通常通稱(chēng)為“跟腱炎”(Achilles Tendinitis)。而伴隨著學(xué)術(shù)界對(duì)于跟腱病變的病理學(xué)和病理生理學(xué)認(rèn)識(shí)的更新,對(duì)“跟腱炎”這種傳統(tǒng)的理論提出了很大的挑戰(zhàn)。Jozsa和Kannus在1997年首先提出了“跟腱退變病”(Achilles Tendinosis)的概念,用以描述由于各種原因所導(dǎo)致的跟腱內(nèi)部組織的缺氧、黏液樣變、脂肪變、透明樣變、纖維樣變及鈣化等多種退行性改變的過(guò)程。跟腱退變病的基本組織病理學(xué)特點(diǎn)是：1、跟腱內(nèi)細(xì)胞增殖活躍,細(xì)胞數(shù)目增加；2、細(xì)胞基質(zhì)成分合成增加；3、跟腱內(nèi)膠原組織排列紊亂,喪失其正常結(jié)構(gòu)；4、跟腱內(nèi)有較多新生血管長(zhǎng)入,跟腱呈富血管化。發(fā)生退變的跟腱大體組織較正常跟腱失去光澤度,呈灰白色,可形成厚薄不均水腫帶和或局部硬結(jié)。其于既往“跟腱炎”概念的最大區(qū)別就是跟腱退變過(guò)程并不能簡(jiǎn)單認(rèn)為是一個(gè)由前列腺素E2介導(dǎo)的原發(fā)性炎癥反應(yīng)過(guò)程,而是一個(gè)細(xì)胞外基質(zhì)膠原纖維在反復(fù)微小應(yīng)力刺激作用下,自我修復(fù)合成紊亂而最終導(dǎo)致退變失用的復(fù)雜過(guò)程。跟腱退變并不是一個(gè)代謝遲滯的過(guò)程,在其退變過(guò)程中細(xì)胞增殖的活躍程度,膠原基質(zhì)合成代謝的轉(zhuǎn)變等都說(shuō)明其是一個(gè)代謝相對(duì)活躍的組織反應(yīng)。上述觀點(diǎn)在既往很多跟腱病的組織活檢和生化及分子生物學(xué)檢測(cè)的結(jié)果中得以明確的證實(shí)。退變跟腱在超負(fù)荷或正常應(yīng)力刺激下,往往會(huì)進(jìn)入失代償?shù)膼盒匝h(huán),最終導(dǎo)致跟腱無(wú)法承受運(yùn)動(dòng)過(guò)程中突然增加的應(yīng)力載荷,而發(fā)生斷裂。有研究證明斷裂的跟腱組織發(fā)生退變的程度常常較嚴(yán)重,但是跟腱退變常可能是隱匿發(fā)病的,大部分跟腱斷裂的患者在發(fā)病之前可能并沒(méi)有明顯的跟腱病變的臨床癥狀,其發(fā)病的隱匿性常常使得人們更容易忽視其危害性,因此更需要謹(jǐn)慎對(duì)待跟腱退變病的自然史,更加詳細(xì)了解跟腱退變病的發(fā)病機(jī)制,才能規(guī)避跟腱退變病發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)因素,制定合理可行的防治策略來(lái)指導(dǎo)跟腱退變病的臨床治療。盡管在過(guò)去的20年中,對(duì)于跟腱退變病的病理過(guò)程有了更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí),但是其病因?qū)W及具體發(fā)病機(jī)制仍然沒(méi)有被完全闡明。主要原因是缺乏有效的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型進(jìn)行跟腱退變病的發(fā)病機(jī)制和治療策略等方面的研究。構(gòu)建有效的跟腱退變病動(dòng)物模型并用以模擬人類(lèi)跟腱退變的發(fā)生發(fā)展,是解決跟腱退變病防治難題的有效途徑之一。在既往研究中成功誘導(dǎo)出若干跟腱退變的模型,可以模擬跟腱退變的病理變化和發(fā)病誘因,但既往模型均有其各自的優(yōu)缺點(diǎn),部分模型存在諸如操作程序復(fù)雜,操作設(shè)備條件要求較高,模型混雜因素較多等缺點(diǎn),因而阻礙了動(dòng)物模型的可重復(fù)性和推廣應(yīng)用,限制了跟腱退變病發(fā)病機(jī)制和防治措施的深入研究。因此有必要構(gòu)建一種操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性強(qiáng)的新型跟腱退變病的動(dòng)物模型,借以更好的研究跟腱退變性疾病防治的相關(guān)體內(nèi)研究。鈣化型跟腱退變病是跟腱退變病的一種特殊類(lèi)型,其特點(diǎn)是跟腱退變伴發(fā)跟腱周?chē)拟}化或者骨化,常嚴(yán)重影響跟腱的正常功能,意味著跟腱斷裂的潛在風(fēng)險(xiǎn)升高,恢復(fù)周期漫長(zhǎng)。跟腱內(nèi)骨化形成可以增加跟腱的剛度,從而代償跟腱受損所導(dǎo)致的生物力學(xué)強(qiáng)度下降。因此從宏觀角度上看,跟腱內(nèi)的骨化可以是做一種病理性的修復(fù)過(guò)程。盡管其病理機(jī)制尚不清楚,多數(shù)研究者傾向于接受“軟骨內(nèi)成骨”的理論,有一點(diǎn)值得肯定的是跟腱內(nèi)的軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化或分化在其發(fā)病過(guò)程中扮演著重要的角色。任何可能影響到軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化或分化的因素都可能會(huì)改變跟腱內(nèi)骨化的病理過(guò)程。從另外一個(gè)角度上看,跟腱內(nèi)骨化形成可視為“異位骨化”,即正常情況下沒(méi)有骨組織的軟組織內(nèi)形成的新生骨。任何對(duì)異位骨化具有預(yù)防和治療作用的手段都可能對(duì)其產(chǎn)生一定療效。瘦素(leptin)是一種大小約為16 kDa的非糖基化肽,由肥胖基因(ob)編碼,主要由白色脂肪細(xì)胞分泌產(chǎn)生進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng),作為一種內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因子,與糖尿病(db)基因編碼的瘦素受體(leptin receptor)結(jié)合后,進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳遞,發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)參與調(diào)節(jié)能量代謝和細(xì)胞功能。自其1994年被發(fā)現(xiàn)后,即迅速被引入了各領(lǐng)域的研究中。目前有若干研究表明瘦素對(duì)軟骨內(nèi)成骨和軟骨細(xì)胞分化成熟的促進(jìn)作用,但其是否參與鈣化型跟腱病的發(fā)病,目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)關(guān)于此內(nèi)容報(bào)道,值得進(jìn)一步系統(tǒng)研究。環(huán)氧合酶-2(COX)是前列腺素E2合成過(guò)程中所必需的關(guān)鍵限速酶,參與調(diào)控炎癥反應(yīng)和細(xì)胞代謝。已有大量研究表明COX-2在異位骨化的發(fā)生過(guò)程中扮演重要角色,以COX-2為靶抑制軟骨內(nèi)成骨的骨化過(guò)程,可能發(fā)揮預(yù)防或抑制異位骨化發(fā)生的作用。假使將鈣化型跟腱退變病視為一種特殊類(lèi)型的異位骨化,COX-2是否在其發(fā)病過(guò)程中扮演重要角色,選擇性抑制COX-2是否會(huì)對(duì)鈣化型跟腱退變病具有一定預(yù)防作用呢?都是值得進(jìn)一步探討的問(wèn)題。目前有研究結(jié)果提示瘦素可能通過(guò)上調(diào)COX-2的活性參與炎癥介導(dǎo)的相關(guān)病理過(guò)程。那么在鈣化型跟腱退變病的發(fā)病過(guò)程中,瘦素是否通過(guò)COX-2依賴(lài)的信號(hào)途徑發(fā)揮作用,COX-2活性的改變是否會(huì)對(duì)瘦素一瘦素受體平衡產(chǎn)生影響,是需要進(jìn)一步闡明的問(wèn)題。二、目的本研究立足于跟腱退變病的研究現(xiàn)狀,為進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)跟腱退變病的發(fā)病機(jī)制,探索鈣化性跟腱退變病的預(yù)防和治療手段,本研究開(kāi)展了如下四個(gè)方面的研究：1、構(gòu)建并驗(yàn)證一種以超負(fù)荷應(yīng)力為誘因的新型鈣化型跟腱退變病動(dòng)物模型。2、借助新型動(dòng)物模型,直接在動(dòng)物水平進(jìn)行系統(tǒng)研究瘦素在鈣化型跟腱退變病發(fā)病中的作用。3、探索塞來(lái)昔布對(duì)于跟腱內(nèi)異位骨化發(fā)生是否具有預(yù)防作用,以及塞來(lái)昔布發(fā)揮抑制作用的關(guān)鍵時(shí)相和劑量。4、在體外試驗(yàn)中,探索在鈣化型跟腱退變病的發(fā)病過(guò)程中,瘦素是否通過(guò)COX-2依賴(lài)的信號(hào)途徑發(fā)揮作用,COX-2活性改變是否會(huì)對(duì)瘦素一瘦素受體平衡產(chǎn)生影響。三、材料和方法1、新型跟腱退變病的動(dòng)物模型的構(gòu)建選取80只SPF級(jí)6周齡C57/B6品系小鼠,雌雄各半,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組麻醉后于無(wú)菌操作條件下行左側(cè)跟腱切斷術(shù),對(duì)照組進(jìn)行皮膚切開(kāi)縫合術(shù)。術(shù)后于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)。術(shù)后12周處死動(dòng)物,取動(dòng)物右側(cè)膝關(guān)節(jié)以下組織,分別對(duì)右側(cè)跟腱進(jìn)行HE染色,甲苯胺蘭染色、免疫組織化學(xué)染色,免疫熒光化學(xué)染色等組織學(xué)評(píng)價(jià)；使用X光平片和Micro-CT掃描進(jìn)行影像學(xué)評(píng)價(jià)；利用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察跟腱內(nèi)結(jié)構(gòu)變化；同時(shí)評(píng)價(jià)其生物力學(xué)性能改變。在動(dòng)物水平和組織學(xué)水平驗(yàn)證小鼠跟腱退變病模型的成功構(gòu)建。2、瘦素在鈣化型跟腱退變病發(fā)病過(guò)程中的作用研究選取40只SPF級(jí)6周齡db/db小鼠和40只6周齡的C57/B6品系野生型小鼠,雌雄各半,db/db小鼠設(shè)為實(shí)驗(yàn)組,C57/B6品系野生型小鼠設(shè)為對(duì)照組,兩組均在麻醉后于無(wú)菌操作條件下行左側(cè)跟腱切斷術(shù)。術(shù)后于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)。術(shù)后12周處死動(dòng)物,取動(dòng)物右側(cè)膝關(guān)節(jié)以下組織,分別對(duì)右側(cè)跟腱進(jìn)行HE染色,番紅O-快速綠染色、免疫組織化學(xué)等組織學(xué)評(píng)價(jià)；使用X光平片和Micro-CT掃描進(jìn)行影像學(xué)評(píng)價(jià)；以明確在瘦素受體突變的情況下,是否影響鈣化型跟腱退變病的發(fā)病。3、環(huán)氧合酶2參與調(diào)控鈣化型跟腱退變病發(fā)病的機(jī)制研究選取6周齡大小的SD大鼠80只,雌雄各半,于麻醉后于無(wú)菌操作條件下行左側(cè)跟腱切斷術(shù),待麻醉蘇醒后隨機(jī)將大鼠分為等分為8組：1、10mg/kg/day Celecoxib喂飼12周組(Single dose group):術(shù)后第2天開(kāi)始每天細(xì)針灌胃喂飼10mg/kg/day Celecoxib水溶液至術(shù)后12周。2、雙倍劑量20mg/kg/day Celecoxib喂飼12周組(Double dose group):術(shù)后第2天開(kāi)始每天細(xì)針灌胃喂飼20mg/kg/day Celecoxib水溶液至術(shù)后12周。3、10mg/kg/day Celecoxib喂飼3周組(3 weeks group):術(shù)后第2天開(kāi)始每天細(xì)針灌胃喂飼10mg/kg/day Celecoxib水溶液至3周,術(shù)后3周后每日喂飼等量的0.9%生理鹽水。4、10mg/kg/day Celecoxib喂飼6周組(6 weeks group):術(shù)后第2天開(kāi)始每天細(xì)針灌胃喂飼10mg/kg/day Celecoxib水溶液至6周,術(shù)后6周后每日喂飼等量的0.9%生理鹽水。5、10mg/kg/day術(shù)后3周起喂飼Celecoxib組(Post 9 weeks group):術(shù)后第2天開(kāi)始每日喂飼等量0.9%生理鹽水至術(shù)后3周,術(shù)后第3周開(kāi)始每天細(xì)針灌胃喂飼10mg/kg/day Celecoxib水溶液至術(shù)后12周。6、術(shù)后6周起喂飼10mg/kg/day Celecoxib組(Post 6 weeks group):術(shù)后第2天開(kāi)始每日喂飼等量0.9%生理鹽水至術(shù)后6周,術(shù)后第6周開(kāi)始每天細(xì)針灌胃喂飼10mg/kg/day Celecoxib水溶液至術(shù)后12周。7、全程未給藥陽(yáng)性對(duì)照組(Postivie control group):術(shù)后不做任何額外藥物喂飼處理直至術(shù)后12周。8、全程生理鹽水喂飼安慰劑對(duì)照組(Placebo group):術(shù)后第2天即開(kāi)始每日細(xì)針灌胃喂飼等量0.9%生理鹽水。所有動(dòng)物均在術(shù)后12周處死,處死后即刻取大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)以下標(biāo)本,分別對(duì)右側(cè)跟腱進(jìn)行HE染色、免疫組織化學(xué)等組織學(xué)評(píng)價(jià)；使用X光平片和Micro-CT掃描進(jìn)行影像學(xué)評(píng)價(jià)；以明確COX-2選擇性抑制劑是否影響鈣化型跟腱退變病的發(fā)病,以及其干預(yù)的合理劑量和干預(yù)時(shí)機(jī)選擇。4、瘦素依賴(lài)COX-2途徑參與鈣化型跟腱退變病的發(fā)病機(jī)制體外實(shí)驗(yàn)研究體外分離培養(yǎng)原代大鼠跟腱細(xì)胞,選用分離培養(yǎng)好SD大鼠原代跟腱細(xì)胞接種于若干24孔板,設(shè)置A組將NS398加入對(duì)應(yīng)孔的培養(yǎng)基中持續(xù)干預(yù)大鼠跟腱細(xì)胞,NS398終末濃度梯度分別為0.2uM,2uM,20uM。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。設(shè)置B組將重組瘦素蛋白加入對(duì)應(yīng)孔的培養(yǎng)基中持續(xù)干預(yù)大鼠跟腱細(xì)胞,瘦素終末濃度梯度分別為50ng/ml,250ng/ml。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。設(shè)置C組使用NS398和瘦素聯(lián)合處理大鼠跟腱細(xì)胞,NS398終濃度為20uM,瘦素重組蛋白終末濃度梯度分別為50ng/ml,250ng/ml。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)7天后,提取細(xì)胞蛋白樣本。使用蛋白免疫印跡法分別檢測(cè)各組細(xì)胞中COX-2,瘦素和瘦素受體的表達(dá),以明確瘦素是否通過(guò)COX-2依賴(lài)的信號(hào)途徑發(fā)揮作用,COX-2活性的改變是否會(huì)對(duì)瘦素一瘦素受體平衡產(chǎn)生影響。四、結(jié)果1、新型跟腱退變病的動(dòng)物模型的構(gòu)建小鼠單側(cè)跟腱切斷12周,對(duì)側(cè)跟腱出現(xiàn)嚴(yán)重水腫并失去正常跟腱光澤,雙側(cè)跟腱內(nèi)出現(xiàn)質(zhì)硬的乳白色結(jié)節(jié)狀物。組織學(xué)檢查顯示對(duì)側(cè)跟腱內(nèi)有大量細(xì)胞浸潤(rùn)和新生血管長(zhǎng)入。電子顯微鏡觀察可見(jiàn)對(duì)側(cè)跟腱內(nèi)出現(xiàn)纖維排列紊亂和膠原融合。X光和Micro-CT檢查發(fā)現(xiàn)對(duì)側(cè)跟腱內(nèi)異位骨化形成,同時(shí)多合并跟骨畸形的發(fā)生。免疫組織化學(xué)檢測(cè)證實(shí)跟腱內(nèi)出現(xiàn)了軟骨內(nèi)成骨和纖維軟骨肥大增生,其骨化過(guò)程是一個(gè)肥大軟骨細(xì)胞骨化成骨的過(guò)程。生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果提示對(duì)側(cè)跟腱的生物力學(xué)性能明顯下降。2、瘦素在鈣化型跟腱退變病發(fā)病過(guò)程中的作用研究X光和Micro-CT檢查的結(jié)果證明db/db小鼠單側(cè)跟腱切斷后雙側(cè)跟腱均未出現(xiàn)骨化發(fā)生。HE染色和番紅O-快速綠染色結(jié)果顯示對(duì)側(cè)跟腱內(nèi)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞浸潤(rùn),膠原纖維排列失穩(wěn),具有少量的血管長(zhǎng)入,腱周組織具有少量細(xì)胞浸潤(rùn)和大量脂肪空泡積聚,但無(wú)軟骨樣細(xì)胞或者軟骨樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。對(duì)側(cè)跟腱免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果跟腱內(nèi)COX-2的表達(dá)較野生型對(duì)照組明顯減少。3、環(huán)氧合酶2參與調(diào)控鈣化型跟腱退變病發(fā)病的機(jī)制研究術(shù)后喂飼塞來(lái)昔布12周可明顯降低大鼠跟腱切斷后異位骨化發(fā)生率。不同劑量的塞來(lái)昔布對(duì)于大鼠跟腱切斷后異位骨化發(fā)生率的影響無(wú)明顯差異。術(shù)后3周起和術(shù)后6周起喂飼塞來(lái)昔布不能明顯降低大鼠跟腱切斷后異位骨化發(fā)生率,兩組之間并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。術(shù)后喂飼塞來(lái)昔布3周后停藥和術(shù)后喂飼塞萊昔布6周后停藥亦不能明顯降低大鼠跟腱切斷異位骨化的發(fā)生率,兩者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。術(shù)后3周起喂飼塞來(lái)昔布較術(shù)后喂飼塞來(lái)昔布6周停藥組,異位骨化發(fā)生率也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。術(shù)后喂飼塞來(lái)昔布12周可明顯降低大鼠跟腱切斷后異位骨化組織的體積。兩種不同劑量的塞來(lái)昔布對(duì)于異位骨化組織的體積無(wú)明顯影響。術(shù)后喂飼塞來(lái)昔布3周組較陽(yáng)性對(duì)照組,異位骨化組織體積無(wú)明顯差異。術(shù)后喂飼塞來(lái)昔布6周停藥組較術(shù)后喂飼塞來(lái)昔布3周停藥組,跟腱內(nèi)異位骨化組織體積明顯要小。術(shù)后3周起喂飼塞來(lái)昔布組較術(shù)后6周起喂飼塞來(lái)昔布組,跟腱內(nèi)異位骨化組織體積明顯要小。術(shù)后3周起喂飼塞來(lái)昔布較術(shù)后喂飼塞來(lái)昔布6周停藥組,跟腱內(nèi)異位骨化組織體積明顯減小。術(shù)后喂飼6周塞來(lái)昔布后停藥組較6周后喂飼塞來(lái)昔布組,跟腱內(nèi)異位骨化組織體積明顯減小。HE組織學(xué)染色結(jié)果示術(shù)后喂飼塞來(lái)昔布12周的兩組中未發(fā)生異位骨化的個(gè)體跟腱組織內(nèi)可見(jiàn)跟腱內(nèi)纖維排列走形紊亂,有大量細(xì)胞浸潤(rùn)和血管生成,少見(jiàn)部分軟骨樣細(xì)胞或軟骨島樣結(jié)構(gòu),未發(fā)現(xiàn)帶有成熟骨髓腔的皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)。其余6組均發(fā)現(xiàn)跟腱內(nèi)纖維排列紊亂,有大量細(xì)胞浸潤(rùn),可見(jiàn)大量肥大軟骨細(xì)胞和被軟骨基質(zhì)包繞軟骨島樣結(jié)構(gòu),周?chē)樯罅垦芙Y(jié)構(gòu),均可在跟腱內(nèi)發(fā)現(xiàn)具有成熟骨髓腔的皮質(zhì)骨樣結(jié)構(gòu)。術(shù)后喂飼塞來(lái)昔布6周停藥組較術(shù)后喂飼塞來(lái)昔布3周停藥組,跟腱內(nèi)肥大軟骨細(xì)胞數(shù)目明顯要少。術(shù)后3周起喂飼塞來(lái)昔布組較術(shù)后6周起喂飼塞來(lái)昔布組,跟腱內(nèi)肥大軟骨細(xì)胞數(shù)目明顯要少。術(shù)后3周起喂飼塞來(lái)昔布較術(shù)后喂飼塞來(lái)昔布6周停藥組,肥大軟骨細(xì)胞數(shù)目無(wú)明顯差異。免疫組化結(jié)果示損傷跟腱內(nèi)瘦素廣泛表達(dá)。4、瘦素依賴(lài)COX-2途徑參與鈣化型跟腱退變病的發(fā)病機(jī)制體外實(shí)驗(yàn)研究不同濃度的NS398可均明顯抑制跟腱細(xì)胞內(nèi)COX-2的表達(dá)。其抑制效果按照NS398濃度梯度依次遞增,其中以20uM濃度抑制效果最佳。不同濃度的NS398呈濃度依賴(lài)性的抑制跟腱細(xì)胞瘦素和瘦素受體表達(dá)。不同濃度的重組瘦素蛋白可均明顯促進(jìn)跟腱細(xì)胞內(nèi)COX-2的表達(dá),其促進(jìn)效果按濃度梯度依次遞增,其中以250ng/ml濃度效果最佳。不同濃度的重組瘦素蛋白呈濃度依賴(lài)性的促進(jìn)細(xì)胞瘦素受體表達(dá)。使用20uM的NS398可以抑制重組瘦素蛋白所激活的COX-2蛋白的表達(dá)。同時(shí)重組瘦素蛋白聯(lián)合NS398共同處理大鼠跟腱細(xì)胞相較于使用空白對(duì)照組,跟腱細(xì)胞中瘦素受體的表達(dá)量未見(jiàn)明顯上調(diào)。五、結(jié)論1、通過(guò)單側(cè)跟腱切斷,誘導(dǎo)對(duì)側(cè)跟腱自然發(fā)生退變,成功構(gòu)建了基于小鼠的一種新型鈣化型跟腱退變病模型,該模型簡(jiǎn)單實(shí)用,可重復(fù)性高,可以較好的模擬人類(lèi)跟腱退變病發(fā)病過(guò)程中的超負(fù)荷應(yīng)力這一主要誘因。該模型為研究鈣化型跟腱退變病的潛在發(fā)病機(jī)制提供了有利研究工具。2、通過(guò)將瘦素受體突變的db/db小鼠作為研究載體,利用本研究第一部分所構(gòu)建的新型動(dòng)物模型,觀察在瘦素受體表達(dá)突變的情況下該疾病模型表型的改變。首次直接證明在瘦素受體突變失用的條件下鈣化型跟腱退變病模型不能發(fā)生骨化。瘦素是軟骨內(nèi)成骨發(fā)生過(guò)程中的必需因素,其對(duì)于鈣化型跟腱退變病的發(fā)病具有重要意義。3、使用塞來(lái)昔布選擇性抑制COX-2可以發(fā)揮抑制跟腱內(nèi)異位骨化發(fā)生的作用。其抑制異位骨化發(fā)生的機(jī)制可能是抑制跟腱內(nèi)干細(xì)胞的異常成軟骨分化和軟骨細(xì)胞的肥大成熟,從而阻抑了異位骨化的啟動(dòng)和進(jìn)展。首次報(bào)道了COX-2在跟腱內(nèi)異位骨化過(guò)程中扮演重要的角色,為COX-2選擇性抑制劑未來(lái)應(yīng)用于鈣化型跟腱退變病的臨床治療提供有力的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4、體外大鼠跟腱細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)在鈣化型跟腱退變病的發(fā)病過(guò)程中,瘦素可能通過(guò)激活誘導(dǎo)COX-2活性,促進(jìn)跟腱細(xì)胞外基質(zhì)降解和跟腱內(nèi)軟骨細(xì)胞化生。在此過(guò)程中跟腱細(xì)胞瘦素受體的表達(dá)上調(diào),可能進(jìn)一步放大瘦素細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。而阻斷COX-2信號(hào)途徑可能抑制瘦素對(duì)跟腱細(xì)胞的所產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng),同時(shí)在一定程度上減弱瘦素細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在跟腱退變病的發(fā)病過(guò)程中,瘦素-瘦素受體信號(hào)通路和COX-2信號(hào)途徑具有較大的關(guān)聯(lián),瘦素依賴(lài)于COX-2的活性促進(jìn)鈣化型跟腱退變病的發(fā)病。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R686
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本文編號(hào)：2467880