【摘要】：研究背景 膿毒癥(sepsis)是指可能存在的或被證實的感染伴隨全身性感染的表現(xiàn),其本質(zhì)是機(jī)體對病原體和免疫原性物質(zhì)的免疫應(yīng)答反應(yīng),是機(jī)體自身免疫性損傷的病理生理過程。膿毒癥相關(guān)性腦病(sepsis associated encephalopathy, SAE)是一種彌散性腦功能障礙,由膿毒癥所致的全身性炎癥反應(yīng)所引起,其特征是無中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、腦解剖結(jié)構(gòu)異常、腦出血或腦栓塞等臨床或?qū)嶒炇乙罁?jù),需排除肝性腦病、腎性腦病或肺性腦病等特異性腦部病變。SAE是膿毒癥病程中最常見的腦功能障礙,發(fā)病率高達(dá)70%,可出現(xiàn)在膿毒癥病程的任何時期,甚至先于膿毒癥的臨床癥狀而出現(xiàn)。SAE臨床癥狀可表現(xiàn)為從輕度譫妄至重度昏迷等不同程度的腦功能紊亂。此外,由于腦功能的特殊性,SAE可通過影響自主神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能而影響其它重要器官的功能,加速多器官功能障礙綜合征的發(fā)生和發(fā)展。目前SAE尚無公認(rèn)的特效療法或特效藥物,治療主要依賴于對膿毒癥的早期、整體治療以及對癥和支持治療。 雖然SAE發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚未完全明確,但是有證據(jù)表明腦組織線粒體損傷是SAE的重要發(fā)病機(jī)制。線粒體是細(xì)胞進(jìn)行生物氧化和能量轉(zhuǎn)換的主要場所,通過氧化磷酸化以三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)的形式為細(xì)胞生命活動提供90%以上的能量,同時線粒體還是丙酮酸和脂肪酸氧化、尿素循環(huán)(鳥苷酸循環(huán))等物質(zhì)代謝的重要場所。此外,線粒體與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、鈣離子代謝以及生成氧自由基等重要的生物活性分子密切相關(guān)。正常的線粒體功能對維持細(xì)胞存活及正常的細(xì)胞功能是必不可少的,線粒體功能障礙與細(xì)胞死亡以及許多人類疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系。由于腦組織幾乎完全依賴從動脈循環(huán)中攝取的葡萄糖和氧在線粒體中代謝提供能量,因而線粒體功能障礙對腦組織的影響尤為突出。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠腦組織線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)、膜電位下降、細(xì)胞色素丟失以及細(xì)胞色素C氧化酶活性顯著下降,腦組織線粒體功能嚴(yán)重受損。還有學(xué)者對膿毒癥大鼠腦組織進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),在海馬、脈絡(luò)膜等血腦屏障通透性較高的區(qū)域,神經(jīng)細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入胞質(zhì)增多導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加。綜上所述,線粒體功能障礙與膿毒癥腦組織細(xì)胞能量供應(yīng)受損以及神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加密切相關(guān),可加劇膿毒癥腦功能障礙,被認(rèn)為是SAE的主要發(fā)病機(jī)制之一 線粒體生物發(fā)生受細(xì)胞核和線粒體生物發(fā)生相關(guān)調(diào)控因子的雙重調(diào)控。線粒體生物發(fā)生是指已有線粒體的生長和分化,通過協(xié)調(diào)地表達(dá)、輸入和裝配細(xì)胞核和線粒體編碼的線粒體蛋白以及調(diào)節(jié)線粒體的內(nèi)容物和形態(tài)而實現(xiàn)。包括腦組織在內(nèi)的線粒體生物發(fā)生均受細(xì)胞核和線粒體生物發(fā)生相關(guān)調(diào)控因子的雙重調(diào)節(jié),這些調(diào)控因子主要包括核呼吸因子-1和核呼吸因子-2(nuclear respiratory factor-1and nuclear respiratory factor-2, NRF-1and NRF-2)——調(diào)控核基因編碼線粒體蛋白,線粒體轉(zhuǎn)錄因子A (mitochondrial transcription factor A, TFAM)——啟動線粒體DNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制,以及過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子-1α (peroxisomal proliferator-activated receptor gamma coactivator1alpha, PGC-la)——線粒體生物發(fā)生的主要調(diào)控因子,調(diào)控NRF-1、NRF-2和TFAM的表達(dá)。 線粒體生物發(fā)生在維持線粒體功能和數(shù)目以滿足真核細(xì)胞生理需要方面具有重要作用。疾病狀態(tài)下,若線粒體損傷后,線粒體生物發(fā)生增強(qiáng)則有助于維持線粒體功能和細(xì)胞能量狀態(tài),進(jìn)而促進(jìn)組織器官修復(fù)；反之,若線粒體生物發(fā)生受損與線粒體功能障礙同時出現(xiàn),則可使線粒體功能進(jìn)一步惡化,加重細(xì)胞、組織功能損傷。已有研究觀察到線粒體生物發(fā)生受損和線粒體功能障礙同時存在于一些腦組織病變中：在阿爾茨默病、帕金森病等以線粒體功能障礙作為主要發(fā)病機(jī)制和顯著特點的神經(jīng)退行性病變中可同時觀察到線粒體生物發(fā)生受損。然而,目前對膿毒癥病程中腦組織線粒體生物發(fā)生受到怎樣的影響尚無系統(tǒng)研究。 星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte)并非僅僅是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中形態(tài)單一的營養(yǎng)支持細(xì)胞,而是一類具有豐富形態(tài)和復(fù)雜功能,并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理活動和病理過程中發(fā)揮十分復(fù)雜和重要作用的細(xì)胞。此外,本課題組在前期實驗研究中發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷具有可逆性。據(jù)此,本研究選用大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞作為研究對象,通過建立膿毒癥星形膠質(zhì)細(xì)胞模型,研究在體外模擬的膿毒癥環(huán)境中,星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體在結(jié)構(gòu)和功能方面的變化以及這種變化與星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體生物發(fā)生之間的聯(lián)系,并且提出假設(shè)：即在體外模擬的膿毒癥環(huán)境中,大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體生物發(fā)生加強(qiáng),有利于維持線粒體功能,促進(jìn)線粒體損傷修復(fù)。 研究目的 通過建立膿毒癥星形膠質(zhì)細(xì)胞模型,研究體外模擬的膿毒癥環(huán)境中,大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能的變化以及這種變化與星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體生物發(fā)生之間的關(guān)系,同時觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體融合和分裂活動的變化,為揭示SAE發(fā)病的分子機(jī)制提供實驗參考。 研究方法 1.組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)原代Sprague-Dawley (SD)大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞。 2.通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定培養(yǎng)細(xì)胞中星形膠質(zhì)細(xì)胞純度：即采用星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體——膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)抗體和小膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體——離子鈣接頭分子-1抗體(ionized calcium binding adapter molecule1, iba-1)對培養(yǎng)細(xì)胞純度進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。 3.建立膿毒癥星形膠質(zhì)細(xì)胞模型：根據(jù)文獻(xiàn)報道,采用大腸桿菌細(xì)胞壁脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)50ng/ml和干擾素-γ (interferon-y, IFN-y)200U/ml與大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共孵育的方法建立膿毒癥星形膠質(zhì)細(xì)胞模型,在體外環(huán)境下模擬膿毒癥對大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響。 4.驗證膿毒癥星形膠質(zhì)細(xì)胞模型：通過檢測膿毒癥星形膠質(zhì)細(xì)胞模型建立后0小時、3小時、6小時、12小時和24小時五個時點星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中腫瘤壞死因子-γ (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)、一氧化氮(nitric oxide, NO)和星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)活性氧族(reactive oxygen species, ROS)濃度,驗證膿毒癥星形膠質(zhì)細(xì)胞模型的建立。 5.實驗分組：根據(jù)干預(yù)因素(50ng/ml LPS和200U/ml IFN-γ)對大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞作用時間的不同,本研究共分為4個實驗組,即0小時組[正常對照組,予等體積10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)／低糖達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle's medium, DMEM)替代50ng/ml LPS工作液和200U/ml IFN-γ工作液與大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共孵育]、6小時組(膿毒癥組,50ng/ml LPS工作液和200U/ml IFN-γ工作液與大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共孵育6小時)、12小時組(膿毒癥組,50ng/ml LPS工作液和200U/ml IFN-γ工作液與大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共孵育12小時)和24小時組(膿毒癥組,50ng/ml LPS工作液和200U/ml IFN-γ工作液與大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共孵育24小時)。 6.評估各實驗組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能變化情況 6.1制作各實驗組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞超薄切片,通過透射電鏡觀察超薄切片中星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)變化。 6.2各實驗組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)評分方法：大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷共分為1至5五個等級,分別評分為0至4分：1級(0分)：正常超微結(jié)構(gòu)線粒體；2級(1分)：早期輕度水腫線粒體,表現(xiàn)為線粒體嵴分離和基質(zhì)密度減低3級(2分)：線粒體水腫較2級更加明顯,表現(xiàn)為線粒體嵴明顯分離和基質(zhì)密度明顯減低；4級(3分)：線粒體廣泛水腫并伴有結(jié)構(gòu)破壞,但內(nèi)外膜尚完整5級(4分)：線粒體廣泛水腫,結(jié)構(gòu)破壞并伴隨內(nèi)外膜破裂。 6.3檢測各實驗組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ATP濃度。 7.評估各實驗組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體生物發(fā)生相關(guān)調(diào)控因子表達(dá)情況 7.1采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)評估轉(zhuǎn)錄水平各實驗組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體生物發(fā)生相關(guān)調(diào)控因子(即PGC-1α、NRF-1、NRF-2α、NRF-2β和TFAM)表達(dá)情況。 7.2采用蛋白質(zhì)印跡法評估翻譯水平(總蛋白)各實驗組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體生物發(fā)生相關(guān)調(diào)控因子(即PGC-1α、NRF-1、NRF-2α、NRF-2β和TFAM)表達(dá)情況。 7.3采用蛋白質(zhì)印跡法評估翻譯水平(核蛋白)各實驗組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞PGC-1α表達(dá)情況。 8.通過凝膠遷移電泳(electrophoretic mobility shift assay, EMS A)實驗檢測各實驗組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞TFAM與線粒體DNA的結(jié)合能力,并通過超遷移分析實驗(super-shift analysis)判斷EMSA實驗中目的遷移條帶的位置。 9.采用RT-PCR方法評估各實驗組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體DNA相對含量。 10.通過“計點網(wǎng)格法”評估各實驗組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體體積密度。 11.采用蛋白質(zhì)印跡法評估各實驗組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體DNA編碼蛋白——線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞單位1(cytochrome C oxidase1, COX1)和線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞單位2(cytochrome C oxidase2,COX2)表達(dá)情況。 12.采用蛋白質(zhì)印跡法評估各實驗組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體融合與分裂活動調(diào)控蛋白——視神經(jīng)萎縮1基因蛋白(optic atrophy1gene protein, OPAl)和動力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein1,DRP1)表達(dá)情況。 13.統(tǒng)計方法：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±standard devition,x±s)表示,多組資料間均數(shù)比較采用方差分析,首先進(jìn)行方差齊性檢驗,方差不齊時采用Welch檢驗結(jié)果。多組均數(shù)間兩兩比較：方差齊者用最小顯著差值法(Least-significant Difference,LSD),方差不齊者用Dunnett'T3法。P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 1.本研究采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)的原代大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞在所培養(yǎng)細(xì)胞中所占比例95%,小膠質(zhì)細(xì)胞在所培養(yǎng)細(xì)胞中所占比例5%；即星形膠質(zhì)細(xì)胞純度95%,符合實驗要求。 2.LPS和IFN-γ與大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共孵育3小時(186.79±40.28pg/ml；54.55±4.08pg/ml).6小時(872.93±82.47pg/ml;49.55±3.72pg/ml)、12小時(705.30±124.95pg/ml;53.77±3.87pg/ml)和24小時(810.93±73.43pg/ml;48.51±2.93pg/ml)后星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α和IL-6濃度較0小時組(17.59±5.77pg/ml;35.80±1.87pg/ml)顯著增加,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05)；同時,LPS和IFN-γ與大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共孵育3小時(16.53±3.02μM；3.31±0.46μM)、6小時(27.31±1.19μM；4.73±0.34μM)、12小時(37.52±1.88μM；9.70±1.78μM)和24小時(39.40±2.16μM；13.39±0.92μM)后星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS和細(xì)胞培養(yǎng)基中NO濃度較0小時組(11.44±1.50μM：2.42±0.28μM)顯著增加,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05)。 3.各實驗組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能變化情況 3.1通過透射電鏡觀察各實驗組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)：在LPS和IFN-γ與大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共孵育建立的膿毒癥星形膠質(zhì)細(xì)胞模型中,6小時組(2.97±0.92)超微結(jié)構(gòu)輕度損傷線粒體(即線粒體超微結(jié)構(gòu)評分為1分線粒體)較0小時組(1.08±0.95)、12小時組(1.70±1.01)和24小時組(1.59±0.55)顯著增多,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；12小時組和24小時組超微結(jié)構(gòu)輕度損傷線粒體(即線粒體超微結(jié)構(gòu)評分為1分線粒體)較0小時組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而正常超微結(jié)構(gòu)線粒體(即線粒體超微結(jié)構(gòu)評分為0分線粒體)和中度超微結(jié)構(gòu)損傷線粒體(即線粒體超微結(jié)構(gòu)評分為2分線粒體)在各實驗組所占比例較0小時組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；實驗過程中未發(fā)現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)重度及極重度損傷線粒體(即線粒體超微結(jié)構(gòu)評分分別為3分和4分線粒體)。 3.2在LPS和IFN-γ與大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共孵育建立的膿毒癥星形膠質(zhì)細(xì)胞模型中,6小時組(1.480.05nmol/mg protein)、12小時組(1.80±0.12nmol/mg protein)和24小時組(1.79±0.14nmol/mg protein)大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞ATP濃度較0小時組(0.93±0.15nmol/mg protein)顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05)。 4.各實驗組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體生物發(fā)生相關(guān)調(diào)控因子表達(dá)情況 4.1通過RT-PCR檢測各實驗組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體生物發(fā)生相關(guān)調(diào)控因子轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)：在LPS和IFN-γ與大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共孵育建立的膿毒癥星形膠質(zhì)細(xì)胞模型中,6小時組和12小時組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞PGC-1α mRNA濃度(1.77±0.06；1.91±0.04)、NRF-1mRNA濃度(1.68±0.21；2.77±0.63)、NRF-2α mRNA濃度(2.33±0.09；2.52±0.25)、NRF-2βmRNA濃度(1.41±0.18；1.72±0.11)和TFAM mRNA濃度(1.54±0.15；1.58±0.10)較0小時組(0.86±0.10；0.96±0.09；0.93±0.09；0.92±0.09；0.91±0.12)顯著升高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05)；24小時組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞PGC-la mRNA濃度(0.95±0.14)、NRF-1mRNA濃度(1.08±0.10)、NRF-2αmRNA濃度(1.03±0.11)和NRF-2βmRNA濃度(1.05±0.11)較0小時組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,而TFAM mRNA濃度(1.20±0.19)仍較0小時組顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 4.2通過蛋白質(zhì)印跡法檢測各實驗組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體生物發(fā)生相關(guān)調(diào)控因子翻譯水平(總蛋白)表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)：在LPS和IFN-γ與大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共孵育建立的膿毒癥星形膠質(zhì)細(xì)胞模型中,6小時組和12小時組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞PGC-1α蛋白濃度(0.91±0.10；0.92±0.16)、NRF-1蛋白濃度(1.00±0.23；0.99±0.31)、NRF-2α蛋白濃度(1.34±0.03；1.41±0.20)、NRF-2β蛋白濃度(0.89±0.04；1.00±0.04)和TFAM蛋白濃度(1.84±0.19；1.78±0.08)較0小時組(0.52±0.11；0.40±0.13;1.06±0.08；0.70±0.14；0.76±0.12)顯著升高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05)；24小時組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞PGC-1α蛋白濃度(0.66±0.15)、NRF-1蛋白濃度(0.74±0.26、NRF-2α(1.04±0.23)和NRF-2p蛋白濃度(0.81±0.09)較0小時組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,而TFAM蛋白濃度(1.35±0.23)仍較0小時組顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 4.3通過蛋白質(zhì)印跡法檢測各實驗組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞PGC-1α翻譯水平(核蛋白)表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)：在LPS和IFN-γ與大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共孵育建立的膿毒癥星形膠質(zhì)細(xì)胞模型中,6小時組(0.63±0.05)和12小時組(0.60±0.03)大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞PGC-1α核蛋白濃度較0小時組(0.42±0.06)顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05)；24小時組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞PGC-1α核蛋白濃度(0.40±0.04)較0小時組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 5.通過EMSA實驗檢測發(fā)現(xiàn),在LPS和IFN-γ與大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共孵育建立的膿毒癥星形膠質(zhì)細(xì)胞模型中,通過超遷移分析實驗證實,兩條遷移帶均為EMSA實驗的目的遷移條帶；通過對各實驗組遷移帶灰度分析發(fā)現(xiàn),各實驗組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞TFAM與線粒體DNA結(jié)合能力無明顯差別。 6.通過RT-PCR實驗檢測發(fā)現(xiàn),在LPS和IFN-γ與大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共孵育建立的膿毒癥星形膠質(zhì)細(xì)胞模型中,12小時組(1.25±0.17)和24小時組(1.33±0.24)大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體DNA相對含量較0小時組(0.90±0.15)顯著增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05),而6小時組(1.06±0.16)大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體DNA相對含量較0小時組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 7.通過“計點網(wǎng)格法”分析發(fā)現(xiàn),在LPS和IFN-γ與大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共孵育建立的膿毒癥星形膠質(zhì)細(xì)胞模型中,24小時組(0.09±0.00)大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體體積密度較0小時組(0.06±0.01)顯著增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而6小時組(0.06±0.01)和12小時組(0.07±0.01)大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體體積密度較0小時組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 8.通過蛋白質(zhì)印跡法檢測發(fā)現(xiàn),在LPS和IFN-γ與大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共孵育建立的膿毒癥星形膠質(zhì)細(xì)胞模型中,6小時組和12小時組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞COX1蛋白濃度(0.86±0.06；1.09±0.14)和COX2蛋白濃度(1.26±0.17；1.41±0.16)較0小時組(0.51±0.04;0.73±0.09)顯著升高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05)；24小時組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞COX1蛋白濃度(0.58±0.06)和COX2蛋白濃度(0.83±0.07)較0小時組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 9.通過蛋白質(zhì)印跡法檢測發(fā)現(xiàn),在LPS和IFN-γ與大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共孵育建立的膿毒癥星形膠質(zhì)細(xì)胞模型中,6小時組和12小時組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞OPA1蛋白濃度(1.21±0.17;1.34±0.06)和DRP1蛋白濃度(1.04±0.05；1.05±0.05)較0小時組顯著升高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05)；24小時組大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞OPA1蛋白濃度(0.73±0.05)和DRP1蛋白濃度(0.65±0.05)較0小時組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論 1.LPS和IFN-γ與大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共孵育可在體外環(huán)境下模擬膿毒癥失控性炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)對星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷。 2.實驗?zāi)摱景Y條件可造成大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)輕度損傷,主要表現(xiàn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體輕度腫脹,線粒體嵴分離和基質(zhì)密度減低。 3.在實驗?zāi)摱景Y條件下,大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體生物發(fā)生增強(qiáng)以應(yīng)對膿毒癥條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞能量需求增加,并最終使輕度損傷線粒體超微結(jié)構(gòu)恢復(fù)。 4.在實驗?zāi)摱景Y條件下,大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體融合與分裂活動增加,以適應(yīng)線粒體生物發(fā)生增強(qiáng),確保線粒體生物發(fā)生過程中線粒體網(wǎng)絡(luò)的合理組織。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R459.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉r，

本文編號：2458106