【摘要】：目的急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是以進行性呼吸窘迫和難治性低氧血癥為臨床特征的急性呼吸衰竭綜合征。膿毒癥是急性呼吸窘迫綜合征的常見病因。目前ARDS的主要治療方式為肺保護性通氣策略、ECCO及相關對癥治療,治療效果欠佳。炎癥是機體抵御病原微生物和組織損傷有效的宿主防御手段。在炎癥刺激的作用下,機體激活大量的炎癥細胞中和或清除致病因子,從而恢復內環(huán)境穩(wěn)態(tài)。炎癥消退是從炎癥激活狀態(tài)恢復到穩(wěn)態(tài)的主動的程序化過程。有關炎癥消退的調控機制廣為接受的是巨噬細胞及其分泌的種類多樣的促炎癥消退介質。近年來多項研究逐漸揭示,CD4+CD25+Treg也是促進急性肺損傷炎癥消退的重要因素之一。CD4+CD25+Treg除了廣為熟悉的淋巴細胞的免疫抑制作用外,還通過非TCR依賴的方式促進組織修復。淋巴細胞活化基因3分子(lymphocyte activation gene3,LAG3,CD223)是免疫球蛋白超家族的一員,已有研究表明LAG3分子與CTLA-4和PD-1相似,作為負性共刺激分子,其激活可負向調控淋巴細胞功能。同時也有研究表明,LAG3是CD4+CD25+Treg抑制性功能最大化的必要條件。LAG3分子在急性肺損傷炎癥消退中扮演何種作用,干預LAG3分子的表達水平能否影響急性肺損傷炎癥消退,目前尚未見報道。為此,本實驗擬以LPS氣管內注射誘導的急性肺損傷為動物模型,觀察病程全程小鼠肺內不同免疫細胞的計數(shù)及LAG3分子在各種淋巴細胞上的表達變化;并探討LAG3基因敲除是否影響小鼠急性肺損傷炎癥消退進程,并以此探索急性肺損傷中炎癥消退延遲的治療合理可靠的免疫靶點。方法1、采用LPS氣管內注射誘導的急性肺損傷模型,建模前及建模后10d測量小鼠體重,評估急性肺損傷在建模后不同時間點炎癥消退的動態(tài)變化。2、采用LPS氣管內注射致急性肺損傷模型,將28只C57BL/6小鼠隨機分為假手術組(n=4)、lps1d組(n=6)、lps4d組(n=6)、lps7d組(n=6)及l(fā)ps10d組(n=6),取肺組織,he染色檢測病理改變,并進行肺損傷評分,評估急性肺損傷在建模后不同時間點炎癥消退的動態(tài)變化;取肺泡灌洗液和肺組織,流式細胞儀檢測急性肺損傷小鼠建模后不同時間點肺泡灌洗液和肺組織中cd4+t淋巴細胞、cd8+t淋巴細胞、cd19+b淋巴細胞、自然殺傷(naturalkiller,nk)細胞、cd4+cd25+調節(jié)性t淋巴細胞(regulatorytcells,treg)、樹突狀細胞(dendriticcell,dc)的計數(shù)動態(tài)變化,以及cd4+t淋巴細胞、cd8+t淋巴細胞、cd19+b淋巴細胞、dc細胞和cd4+cd25+調節(jié)性t淋巴細胞上的lag3表達水平。3、利用lag3基因敲除小鼠及野生型小鼠建立急性肺損傷模型,隨機分為假手術組(n=4)及l(fā)ps組(n=6),建模術前及術后10d每天記錄每只小鼠體重變化。4、利用lag3基因敲除小鼠及野生型小鼠建立急性肺損傷模型,各28只。組內在隨機分為假手術組(n=4)、lps1d組(n=6)、lps4d組(n=6)、lps7d組(n=6)及l(fā)ps10d組(n=6)。56只小鼠分兩批同時建模,取肺組織行病理切片染色觀察及肺損傷病理評分;取肺泡灌洗液,檢測中性粒細胞計數(shù)及總蛋白含量;檢測cd4+cd25+treg的計數(shù)。結果1、假手術組10d內體重略有增加,無統(tǒng)計學意義。lps組體重1d下降;4d降至最低,與1d相比有統(tǒng)計學意義;7d體重明顯下降,10d基本恢復正常。2、假手術組在各個時間點均無明顯肺組織病理學改變。lps組的肺組織病理損傷評分1d最高;4d稍有下降,與1d相比無統(tǒng)計學意義;7d評分明顯下降,10d基本恢復正常。3、急性肺損傷術后,小鼠肺泡灌洗液中cd11b+ly6g+中性粒細胞、cd11c+mhcⅡ+cd11b+dc、nk1.1+nk細胞的計數(shù)1d升高、4d達到高峰,7d下降(p值均小于0.05);小鼠肺泡灌洗液中cd4+t淋巴細胞、cd4+cd25+treg4d開始出現(xiàn)升高、7d達到高峰,,10d仍未見明顯下降(p值均小于0.05);小鼠肺泡灌洗液中cd8+t淋巴細胞、cd19+b細胞及dc細胞數(shù)量未見明顯變化。小鼠肺組織中各類免疫細胞的變化與肺泡灌洗液中的變化類似。4、急性肺損傷術后,小鼠肺泡灌洗液及肺組織中cd4+t細胞及cd4+cd25+treg細胞表面的lag3表達呈現(xiàn)出相似的變化趨勢,4d開始出現(xiàn)升高、7d達到高峰(p值均小于0.05)。cd8+t細胞及cd19+b細胞上的lag3表達水平未見明顯變化。5、利用lag3基因敲除小鼠(lag3ko)及野生型小鼠建立急性肺損傷模型,lag3基因敲除小鼠及野生型小鼠術后1d體重出現(xiàn)降低,4d降至最低,此后出現(xiàn)回升。與野生型小鼠相比,lag3ko小鼠術后7d體重回升小,10d仍未恢復至術前水平(p值均小于0.05)。lag3ko小鼠及野生型小鼠間比較,1d及4d的體重未見統(tǒng)計學差異;建模后1d和4d,lag3ko小鼠及野生型小鼠肺損傷病理評分無差異。建模后7d及10d,lag3基因敲除小鼠病理損傷評分均高于野生型小鼠(p值均小于0.01)。6、利用lag3基因敲除小鼠及野生型小鼠建立急性肺損傷模型,建模后1d和4d,lag3基因敲除小鼠及野生型小鼠肺泡灌洗液中性粒細胞計數(shù)無差異。建模后7d及10d,lag3基因敲除小鼠肺泡灌洗液中性粒細胞計數(shù)均高于野生型小鼠(p值均小于0.01)。7、利用lag3基因敲除小鼠及野生型小鼠建立急性肺損傷模型,建模后1d和4d,lag3基因敲除小鼠及野生型小鼠肺泡灌洗液總蛋白含量無差異。建模后7d及10d,lag3基因敲除小鼠肺泡灌洗液總蛋白含量均高于野生型小鼠(p值均小于0.01)。8、利用lag3基因敲除小鼠及野生型小鼠建立急性肺損傷模型,結果提示7d及10d這兩個時間點,lag3基因敲除小鼠treg數(shù)量較野生型小鼠顯著下調,有統(tǒng)計學意義(p值均小于0.01)。在1d和4d這兩個時間點,兩種小鼠間比較無統(tǒng)計學差異。結論本模型急性肺損傷在1d-4d為肺部炎癥的急性期,7d-10d為炎癥消退期。肺內各類免疫細胞數(shù)量的動態(tài)改變提示中性粒細胞、dc細胞、nk細胞主要作用于肺損傷炎癥急性期,cd4+t細胞、cd4+cd25+treg細胞及巨噬細胞主要作用于肺損傷炎癥消退期。其中cd4+cd25+treg的數(shù)量在急性肺損傷炎癥消退期出現(xiàn)增多且lag3在cd4+cd25+treg上的表達在炎癥消退期也出現(xiàn)上調。lag3基因敲除小鼠急性肺損傷炎癥消退出現(xiàn)延遲,提示lag3參與調控急性肺損傷炎癥消退,可能與lag3對CD4+CD25+Treg的功能調控有關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R563.8

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