【摘要】：肌腱病(Tendinopathy)的發(fā)病率極高,是骨科、運動醫(yī)學(xué)、康復(fù)醫(yī)學(xué)、職業(yè)病防治和老年醫(yī)學(xué)的常見疾病。肌腱病嚴重影響人們的工作與生活,特別影響運動員競技水平的發(fā)揮,常迫使優(yōu)秀運動員提早退役。肌腱病的主要臨床表現(xiàn)為肌腱或肌腱-骨胳連接處的疼痛、壓痛甚至斷裂、關(guān)節(jié)活動度受限。肌腱腱病最常見的發(fā)病部位依次為髕腱、跟腱、岡上肌腱肩袖、指深屈肌腱及肱骨外上髁伸肌總腱止點。足底筋膜炎、跟腱炎、髕腱炎、網(wǎng)球肘、高爾夫肘、岡上肌腱炎都是肌腱病。雖然肌腱病如此常見,其發(fā)病機制仍不清楚,常認為與肌腱韌帶的急慢性損傷有關(guān)。 新近發(fā)現(xiàn)的肌腱干/祖細胞(Tendon stem/progenitor cells, TSPCs),也稱為肌腱干細胞(tendon stem cells, TSCs)或肌腱源性干細胞(tendon-derived stem cells, TDSCs),經(jīng)傳代培養(yǎng)后可直接成為腱細胞,具有成體干細胞的自我復(fù)制和誘導(dǎo)成脂、成軟骨、成骨分化的潛能,是腱細胞的前體細胞。研究表明,TSCs參與肌腱的急慢性損傷修復(fù),是肌腱急慢性損傷修復(fù)過程中的關(guān)鍵效用細胞。不同劑量的反復(fù)循環(huán)機械應(yīng)力刺激可影響肌腱干細胞力學(xué)生物學(xué)行為,進一步導(dǎo)致肌腱內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和肌腱病的發(fā)生。應(yīng)用體外循環(huán)機械牽伸系統(tǒng)模擬細胞在體反復(fù)機械應(yīng)力狀態(tài),證明4%的機械拉伸能增加TSCs增殖、促進TSCs成為腱細胞,然而8%的機械拉伸可誘導(dǎo)TSCs分化為脂肪、軟骨和骨細胞�？梢�,小的機械拉伸(有序和適度的體育鍛煉)可促進TSCs增殖并成為腱細胞,有利于肌腱的強壯及肌腱的健康；而持續(xù)較大的機械負荷(如過度勞損)是有害的,它促使肌腱干細胞分化為非腱細胞,導(dǎo)致脂肪堆積、黏液形成和肌腱鈣化,表現(xiàn)為肌腱病的典型病理變化�？梢�,TSCs可能是探索肌腱病的突破口。 因為對肌腱病還沒有本質(zhì)認識,臨床治療還往往是經(jīng)驗性的。治療方法包括：局部制動休息、減負訓(xùn)練、按摩冷療、離心型運動、口服非甾體類抗炎藥物、局部注射富血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)、細胞療法、體外沖擊波術(shù)、嚴重時可給予糖皮質(zhì)激素等治療。對于保守治療無效、臨床癥狀持續(xù)較重者,可給予外科手術(shù)治療。在這些治療方法中,PRP局部注射具有自體來源、制作簡單、可制作成凝膠狀、臨床使用安全、方便、經(jīng)濟等優(yōu)點,倍受醫(yī)生和患者的歡迎。因此,臨床應(yīng)用PRP局部注射治療“肌腱病”值得我們關(guān)注。 PRP是全血經(jīng)過梯度離心分離獲得的、含有超過基線水平的濃縮血小板血漿。一般而言,血小板含量至少要達到正常血的3-5倍才能稱之為PRP。當PRP被激活后,其血小板釋放出大量的生長因子,包括血小板衍生生長因子(PDGF),轉(zhuǎn)化生長因子p(TGF-p),血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF),纖維生長因子(FGF),內(nèi)皮細胞生長因子(EGF),血小板衍生內(nèi)皮細胞生長因子(PDEGF),胰島素樣生長因子(IGF)等。這些生長因子對細胞的增殖和分化有著重要的作用,能夠刺激損傷組織血管神經(jīng)化、為細胞修復(fù)或再生損傷組織提供血供和營養(yǎng)。 體外研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PRP能促進TSCs增殖和成腱細胞形成,動物實驗研究也已證實這一結(jié)果,一些臨床試驗也已經(jīng)驗證PRP能夠促進肌腱和韌帶急慢性損傷的愈合和有效治療肌腱病。然而,PRP局部注射治療肌腱和韌帶的急慢性損傷和肌腱病并不總是令人滿意,有一些臨床試驗卻發(fā)現(xiàn)PRP對肌腱和韌帶急慢性損傷的修復(fù)和肌腱病的治療無益。因此,應(yīng)用PRP治療肌腱病仍需進一步基礎(chǔ)與臨床研究。 我們知道,臨床應(yīng)用的PRP是個體化準備的,沒有明確的定義。因而,每一個人的PRP都可能不一樣,并且在某些情況下,有些病人不能成功獲得PRP。仔細分析PRP的制備過程及其組成成份,我們發(fā)現(xiàn)只有兩類(共有4種)不同的PRP在臨床使用：其中一類含白細胞(L-PRP和L-PRF),另一類不含白細胞(P-PRP、P-PRF)。有研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用富含白細胞的PRP有較乏白細胞的PRP更為嚴重的急性炎癥反應(yīng)。因為TSCs是肌腱急慢性損傷修復(fù)的關(guān)鍵效用細胞,我們假設(shè)L-PRP不利于肌腱和韌帶的愈合是因為L-PRP會抑制TSCs的正�；钚�。 本課題為證實上述假設(shè)共分為3章,即肌腱干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定；P-PRP和L-PRP的制備和鑒定；P-PRP和L-PRP對TSCs增殖、分化和細胞力學(xué)的影響。研究目的是為臨床合理應(yīng)用PRP局部注射治療肌腱病提供理論依據(jù)。 第一章兔肌腱干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 目的：分離和鑒定兔肌腱干細胞(TSCs)并評估其干細胞特性為下一步實驗做準備。研究內(nèi)容包括：(1)TSCs的分離及培養(yǎng)；(2)TSCs的克隆形成能力及增殖能力檢測；(3)TSCs的流式細胞儀及免疫熒光鑒定；(4)TSCs的成脂、成軟骨、成骨分化能力測定。 方法：從新西蘭大白兔中獲取TSCs已經(jīng)匹茲堡大學(xué)實驗動物應(yīng)用學(xué)會批準(IACUC批準號：1105545A)。選用3月齡健康雄性新西蘭大白兔。兔處死后從后肢的跟腱取細胞并進行TSCs培養(yǎng),觀察克隆形成、進行干細胞鑒定和到P3后行成脂、成軟骨、成骨誘導(dǎo)。 結(jié)果：體外培養(yǎng)7天后,肌腱來源細胞(Tendon-derived cells, TDCs)已經(jīng)形成克隆。流式細胞術(shù)對細胞表面抗原標志進行了分析,結(jié)果顯示TDCs表面抗原干細胞標志CD90、CD44均呈強陽性。免疫熒光的方法對干細胞特征性標志物(NS, Nanog, Oct-4, SSEA4)進行了檢測,染色細胞經(jīng)免疫熒光顯微鏡觀察。結(jié)果顯示80%的TDCs細胞均表達陽性。成脂誘導(dǎo)分化后,細胞增殖緩慢,細胞中出現(xiàn)脂滴,并逐漸增大、融合,油紅-O染色可見細胞內(nèi)大小不等的紅色脂滴。成軟骨誘導(dǎo)分化4周,固定細胞,經(jīng)番紅-O染色,細胞微團被染為紅色。成骨誘導(dǎo)分化4周后,TDCs細胞呈層疊樣生長,局部出現(xiàn)鈣鹽沉積,形成礦化結(jié)節(jié),鈣鹽沉積處Alizarin red S染色成紅色。 小結(jié)：本研究獲取的TDCs是肌腱干細胞(TSCs),具有克隆形成能力及快速增殖能力,細胞表面抗原CD90、CD44表達呈陽性,而CD34表達呈陰性,干細胞特異性標志物NS、Nanog、SSEA4和OCT-4表達陽性,在成骨、成脂和成軟骨誘導(dǎo)條件下,可以分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等,具有多向分化潛能,可用于下一步研究。 第二章P-PRP和L-PRP的制備及P-PRP及L-PRP對TSCs的影響 為了明確是否是PRP中的白細胞影響了PRP的療效,本研究將分別制備P-PRP和L-PRP及研究P-PRP與L-PRP對TSCs的作用,以進一步確定L-PRP對肌腱韌帶修復(fù)的不利影響,明確P-PRP對肌腱韌帶修復(fù)的積極作用。 方法：選用3月齡、體重2.5kg的健康雄性新西蘭大白兔8只(匹茲堡大學(xué)實驗動物中心提供,IACUC Protocol number:1105545A),乙醚麻醉后,在嚴格無菌條件下,用預(yù)先含有3.8%ACD抗凝劑(sodium citrate)溶液的注射器從心臟采集新鮮抗凝血并置于冰水混合物中。小心緩慢地將6mL的新鮮血注入盛有6mL Polymorphprep (Accurate ChemicalScientific Crop NY)的試管中,置4℃離心機中予以400g/m離心30分鐘后手工分離出P-PRP和L-PRP,應(yīng)用自動細胞計數(shù)儀(Nexcelom Bioscience LLC, Lawrence, Massachusetts)對P-PRP和L-PRP所含的白細胞進行計數(shù)。P-PRP和L-PRP均用22mM CaCL2進行激活并存于4℃冰箱中備下一步實驗用。將準備好P-PRP和L-PRP培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中除含或未含P-PRP或L-PRP外,其他成分一樣(20%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、低糖DMEM),分析各培養(yǎng)基中的細胞因子；將兔來源的TSCs接種在含P-PRP、L-PRP (0%,2%,5%,10%)培養(yǎng)基或普通培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板中(10000個細胞／孔)并在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng);培養(yǎng)至1、2、4天觀察細胞形態(tài),至第4天用自動細胞計數(shù)儀(Nexcelom Bioscience LLC, Lawrence, Massachusetts)行細胞計數(shù)并計算PDT,流式細胞儀檢測其干細胞特征性細胞表面標志物;觀察P-PRP組、L-PRP組和對照組TSCs經(jīng)成脂、成軟骨和成骨誘導(dǎo)28天后其多分化潛能；qRT-PCR分析P-PRP和L-PRP對TSCs基因表達的影響,PRP與白細胞對TSCs的相互影響；CTFM測定P-PRP和L-PRP對TSCs細胞力學(xué)的影響。 結(jié)果：加入離心液一次梯度離心可制備高濃度的PRP。PRP中的血小板量為1.44×108±0.84×108/mL(P0.05),與全血比較,其血小板濃縮率為3.25±0.73。P-PRP中的白細胞數(shù)為0.6625×105±0.36×105/mL,L-PRP中的白細胞數(shù)為3.2775×105±1.22×105/mL(P=0.019)(mean±SD, n=8)。所有培養(yǎng)基(P-PRP培養(yǎng)基、L-PRP培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基)均在配制好后即用ELISA法測定其生長因子(PDGF, EGF, TGF-β1, VEGF)的濃度。P-PRP培養(yǎng)基有較L-PRP培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基更高濃度的生長因子,特別是EGF和TGF-β1。L-PRP培養(yǎng)基中VEGF濃度較普通培養(yǎng)基還低,說明白細胞可能抑制PRP釋放生長因子(P-PRP與L-PRP培養(yǎng)基比較,P0.05,n=3)；L-PRP培養(yǎng)基組不貼壁細胞增加；其干細胞特征性細胞表面標志物CD44和CD90發(fā)生變化,經(jīng)P-PRP處理,CD44和CD90都表達增加,經(jīng)L-PRP處理則相反(P-PRP與L-PRP組比較,P0.05,n=3)；PDT與PRP白細胞的濃度有關(guān),當增加P-PRP的濃度或降低L-PRP濃度時,PDT縮短(組內(nèi)和組間比較,P0.05,n=3)：培養(yǎng)4天、14天后,L-PRP的濃度越高,Nang、Oct4基因表達越下調(diào)(L-PRP組內(nèi)和L-PRP組與P-PRP組比較,P0.05,n=3)；經(jīng)28天的成脂、成軟骨和成骨誘導(dǎo)后,P-PRP培養(yǎng)基組、L-PRP培養(yǎng)基組和普通培養(yǎng)基組的TSCs均被成功誘導(dǎo)。然而,L-PRP培養(yǎng)基組陽性細胞染色數(shù)明顯較P-PRP培養(yǎng)基組和普通培養(yǎng)基組。與P-PRP培養(yǎng)基組和普通培養(yǎng)基組比較,L-PRP培養(yǎng)基組成脂、成軟骨和成骨分化明顯增加(組內(nèi)比較,P0.05,n=3)；各基因與P-PRP和L-PRP的濃度密切相關(guān)。L-PRP的存在,PPARγ、SOX-9、Runx-2、mPGEs基因表達就明顯上調(diào)。(L-PRP組內(nèi)和L-PRP組與P-PRP組比較,P0.05,n=3)；L-PRP培養(yǎng)基組的最大細胞收縮力明顯小于P-PRP培養(yǎng)基組和普通培養(yǎng)基組,組間比較有顯著性差異(P=0.006、0.002,n=5),但P-PRP培養(yǎng)基組與普通培養(yǎng)基比較則未見顯著性差異(P=0.609、0.002,n=5)；WBC組的COX-1和COX-2基因明顯上調(diào),但WBCs的這種作用可以明顯被PRP抵消；PRP組Ⅰ型膠原基因(Col-Ⅰ)表達上調(diào),但這種作用可以明顯被WBC處理抑制；WBC組還明顯有MMP-13基因表達的增加,這種表達增加可以被PRP抵消。 小結(jié)：本研究中通過加入離心液一次梯度離心分離制備出P-PRP和L-PRP,其所含的白細胞有顯著的差異。與P-PRP和空白對照比較,L-PRP會抑制TSCs的增生、加速TSCs的分化、并使TSCs脆性增加；經(jīng)WBCs處理后,TSCs的炎癥反應(yīng)介質(zhì)基因COX-1和COX-2表達增加,細胞分解代謝的基因Ⅰ型膠原表達減少但MMP-13表達增加。這些發(fā)現(xiàn)支持臨床所見的肌腱病發(fā)病機制,因而,我們可以合理地推斷P-PRP可以促進肌腱韌帶的愈合而L-PRP可能抑制肌腱韌帶的愈合。因此,我們應(yīng)該用P-PRP而不是含有白細胞的L-PRP治療肌腱病。 第三章P-PRP膠-TSCs復(fù)合物的構(gòu)建及TSCs的體內(nèi)、外示蹤 將P-PRP膠作為載體負載TSCs構(gòu)建成P-PRP膠-TSCs復(fù)合物并植入目標部位,并監(jiān)測TSCs植入體內(nèi)后其生物學(xué)活性。 方法：應(yīng)用SPIO標記TSCs、分析SPIO對TSCs生物學(xué)功能的影響；構(gòu)建P-PRP膠-TSCs復(fù)合物；體外MRI觀察經(jīng)SPIO標記的TSCs在P-PRP膠內(nèi)的分布情況；建立兔髕韌帶窗式缺損模型,用P-PRP膠-TSCs復(fù)合物進行修復(fù),MRI連續(xù)檢測追蹤經(jīng)SPIO標記的TSCs并檢驗P-PRP膠作為載體的可行性；免疫熒光檢測評價P-PRP膠-TSCs植入體內(nèi)3周后其TSCs的Ⅰ型膠原合成能力,以觀察TSCs植入體內(nèi)3周后的生物學(xué)性能；明確P-PRP膠作為TSCs載體用于治療急慢性肌腱損傷和肌腱病的可行性。 結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)TSCs經(jīng)胞吞作用攝入SPIO,可見SPIO在細胞漿內(nèi)并圍繞在細胞核周圍。細胞標記率約98%。經(jīng)SPIO標記的TSCs細胞形態(tài)未見明顯改變；細胞增殖也未見明顯改變,表現(xiàn)為PDT與未標記TSCs比較無顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),說明SPIO標記不會影響細胞的增殖功能；分別于標記后2、4、7天檢測細胞的活力,發(fā)現(xiàn)其活力都在90%左右,與未標記細胞比較也無明顯差異,說明SPIO標記不會明顯干擾TSCs的細胞活力(P0.05)；經(jīng)免疫組織化學(xué)方法證實SPIO標記組TSCs和未標記組nucleostemin和Nanog表達率都為約90%,沒有明顯差別(P0.05)；經(jīng)qRT-PCR檢測,我們發(fā)現(xiàn)標記TSCs和未標記TSCs相比,在標記后4、7、14天,其Oct-4和Nanog基因表達都沒有明顯差別(P0.05);經(jīng)21天的成脂、成軟骨和成骨分化,兩組未見明確差異；其PPAR、Sox9和Runx2基因表達也無明顯差異(P0.05)。體夕P-PRP膠-TSCs復(fù)合物經(jīng)3T MR掃描發(fā)現(xiàn)經(jīng)SPIO標記的TSCs其MRI信號與標記細胞數(shù)呈線性改變,說明TSCs可均勻分散在P-PRP膠中；體內(nèi)P-PRP膠-TSCs復(fù)合物經(jīng)3T MR掃描發(fā)現(xiàn)經(jīng)SPIO標記的TSCs連續(xù)3周其MRI信號沒有明顯變化。術(shù)后3周局部表現(xiàn)為肌腱缺損已有組織填充,經(jīng)普魯氏蘭染色證實MRI顯影的細胞就是經(jīng)SPIO標記的TSCs,說明TSCs能持續(xù)停留在目標部位至少3周。從組織修復(fù)的角度考慮,3周的時間足于完成急性炎癥期,目的細胞能停留在目標部位3周以上就可能發(fā)揮其生理功能,達到治療目的。再次,經(jīng)免疫組織化學(xué)染色證實P-PRP膠負載的TSCs在體內(nèi)3周后出現(xiàn)明顯的Ⅰ型膠原的表達,說明TSCs已經(jīng)發(fā)揮生理作用�？梢奝-PRP膠可以作為TSCs細胞治療或組織工程的載體。 小結(jié)：用SPIO標記TSCs不會明顯干攏其干性、負載TSCs的P-PRP膠修復(fù)兔髕韌帶窗式缺損術(shù)后2周和3周連續(xù)經(jīng)MRI觀察均未見明顯影像學(xué)改變、經(jīng)普魯氏蘭染色證實MRI顯影的細胞就是SPIO標記的TSCs,說明存在于P-PRP膠內(nèi)作為目的細胞的TSCs可以穩(wěn)定維持在目標部位,且TSCs植入體內(nèi)3周后能合成Ⅰ型膠原,說明TSCs可用SPIO進行標記、P-PRP膠可作為TSCs的良好載體。 結(jié)論：本研究成功地從兔跟腱分離培養(yǎng)出TDCs。這些細胞有克隆形成能力、快速增殖能力和多向分化潛能,經(jīng)流式細胞儀證實干細胞表面特征性標志物陽性,經(jīng)免疫熒光染色證實干細胞特征標志物染色陽性,從而確定為肌腱干細胞；經(jīng)一次離心可簡便制備出較高濃度的PRP并成功分離出P-PRP和L-PRP;發(fā)現(xiàn)L-PRP,這種含白細胞的PRP,會抑制。TSCs增殖、加速TSCs分化并使TSCs脆性增加、加大TSCs的細胞炎癥反應(yīng)及細胞分解代謝�；蛟S,我們應(yīng)該用P-PRP而不是含有白細胞的L-PRP來治療肌腱病。P-PRP膠是TSCs細胞治療和肌腱組織工程潛在的良好支架。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R686.1

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本文編號：2379731