發(fā)布時(shí)間：2018-12-15 00:47

【摘要】：目的：本實(shí)驗(yàn)旨在探討維生素D結(jié)合蛋白(VDBP)及維生素D相關(guān)代謝物在評(píng)估膿毒癥預(yù)后的價(jià)值,并進(jìn)一步在膿毒癥動(dòng)物模型及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)水平驗(yàn)證維生素D結(jié)合蛋白在膿毒癥繼發(fā)多器官功能不全的作用機(jī)制。方法：(1)收集我院2013-2015年重癥監(jiān)護(hù)病房(外科、呼吸科及急診科)住院的膿毒癥患者(滿足膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)sepsis 2.0)的臨床資料。應(yīng)用ELISA分別檢測(cè)78例膿毒癥組和50例健康對(duì)照組血清VDBP.25(OH)D3、1,25(OH)2D3及IL-6水平。記錄患者的生命體征、血常規(guī)、血生化、PCT、CRP、凝血功能等資料。比較不同預(yù)后膿毒癥患者VDBP及維生素D相關(guān)代謝物和其他臨床相關(guān)指標(biāo)的差異以及相關(guān)性。(2)應(yīng)用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)構(gòu)建小鼠膿毒癥模型,收集小鼠術(shù)后1d、3d、5d、7d的血清、尿液以及肝臟、肺臟、腎臟、脾臟等組織,應(yīng)用ELISA檢測(cè)小鼠血清及尿液VDBP水平,HE染色比較病理損傷程度,VDBP免疫組化方法比較VDBP的器官分布,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)知western-blot方法比較不同手術(shù)組間VDBP的mRNA和蛋白表達(dá)差異與凋亡蛋白caspase3的相關(guān)性。(3)應(yīng)用qRT-PCR知western-blot方法比較不同濃度LPS(0ng/ml,10ng/ml、100ng/ml、 1ug/ml、10ug/ml)和不同誘導(dǎo)時(shí)間(Oh、6h、12h、24h和48h)對(duì)HepG2肝細(xì)胞系合成VDBP的影響,以及與凋亡、增殖的相關(guān)性；構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)過表達(dá)及敲減VDBP的RAW264.7巨噬細(xì)胞株,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)比較VDBP不同表達(dá)水平對(duì)LPS(1ug/ml)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的影響,應(yīng)用qRT-PCR知western-blot探討VDBP調(diào)控LPS介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡相關(guān)caspase、MAPK、NF-κB通路。結(jié)果：(1)膿毒癥死亡組年齡、尿素氮、APACHE Ⅱ評(píng)分、SOFA評(píng)分顯著高于生存組,血清25 (OH) D3、1,25 (OH) 2D3及VDBP水平顯著低于生存組。年齡是膿毒癥患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,25(OH)D3是獨(dú)立保護(hù)性因素。VDBP與肝功能(ALB、TP)及凝血指標(biāo)(PA、FIB)具有較好的相關(guān)性(P0.05)。(2)膿毒癥小鼠血清VDBP水平低于假手術(shù)組,以術(shù)后第5天水平最低,與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。膿毒癥小鼠尿液VDBP水平低于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且尿液VDBP水平與血液VDBP水平呈正相關(guān)。膿毒癥狀態(tài)下,小鼠出現(xiàn)肝臟、肺臟、脾臟、腎臟等多臟器損傷,CLP組各損傷器官的炎細(xì)胞浸潤(rùn)部位VDBP免疫組化灰度值顯著高于假手術(shù)組,VDBP血清水平與組織損傷程度呈負(fù)相關(guān)。膿毒癥狀態(tài)下,肝臟合成VDBP能力下降,與肝組織損傷及凋亡相關(guān)。(3)隨著LPS誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)及濃度的增加，，HepG2肝細(xì)胞合成VDBP水平及細(xì)胞增殖能力下降,凋亡增加。VDBP穩(wěn)轉(zhuǎn)過表達(dá)組與敲減組相比,LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞凋亡比例顯著增加,與Caspase(caspase-3,caspase-8, caspase-9知caspase-12)通路、MAPK(P-P38,P-JNK,P-ERK)通路及NF-κB(P-NF-κB)通路相關(guān)。結(jié)論：(1)25 (OH) D3、1,25 (OH) 2D3及VDBP水平對(duì)膿毒癥的預(yù)后具有預(yù)警價(jià)值,其中25(OH)D3是獨(dú)立保護(hù)性因素；VDBP與肝功能及凝血指標(biāo)具有較好的相關(guān)性,可以對(duì)膿毒癥患者肝功能損傷及凝血障礙早期預(yù)測(cè)。(2)膿毒癥狀態(tài)下,血清及尿液VDBP水平可以間接反映肝臟合成障礙及肺臟、脾臟等組織的損傷程度。(3)LPS可通過影響經(jīng)典凋亡通路干預(yù)肝細(xì)胞合成VDBP的能力；VDBP可通過Caspase通路、MAPK通路及NF-κB通路介導(dǎo)LPS刺激的巨噬細(xì)胞凋亡。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R459.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Caspase Family Proteases and Apoptosis[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2005年11期

本文編號(hào)：2379627