【摘要】：研究背景與目的膿毒癥(sepsis)是病原體(pathogen,PA)感染機體后,因PA所釋放的病原體相關分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)被體內(nèi)的模式識別受體(pattern recognition receptor,PRRs)識別所引發(fā)的失控性炎癥反應綜合癥;在PAMPs中,存在于革蘭陰性細菌外膜的脂多糖/內(nèi)毒素(lipopolysaccharide,LPS)是至今研究最為深入的一種PAMP,是誘發(fā)膿毒癥的重要PAMP。因此研究針對LPS的拮抗和清除機制,對膿毒癥的預防和治療具有重要意義�？嗫掳稡(Kukoamine B,KB)是我們課題組在前期研究中從傳統(tǒng)中藥地骨皮中發(fā)現(xiàn)、分離并已實現(xiàn)全化學合成的一種生物堿類化合物,KB在體內(nèi)外具有中和LPS的致炎生物學效應,可顯著提高膿毒癥模型動物的生存率,該化合物現(xiàn)已完成Ⅰ期臨床試驗。KB拮抗膿毒癥的作用機制在于與LPS具有高親和力的結(jié)合作用,這種結(jié)合作用使其與LPS結(jié)合并形成KB/LPS復合物后,從而阻斷了LPS的致炎生物學效應,但所形成的KB/LPS復合物在體內(nèi)是如何分布、代謝以及有無蓄積的可能性等等均不清楚。因此探索KB/LPS復合物在體內(nèi)的分布、代謝,對深入闡明KB的作用機制和安全性具有重要意義。為解決上述問題,本課題擬以熒光素分別標記LPS、KB以及研究中涉及的細胞和受體等,并應用激光共聚焦(laser scanning confocal microscopy,LSCM)、流式細胞術(shù)(flow cytometry,FCM)、siRNA干擾等技術(shù)探索KB/LPS復合物在體內(nèi)的分布及代謝的分子機制。方法:1.KB/LPS復合物形成后對LPS在體內(nèi)分布影響的研究以FITC標記LPS(FITC-LPS)對KB/LPS復合物進行示蹤,取FITC-LPS(1mg/kg)與KB(3.6mg/kg)體外混勻,37℃,振蕩30min制備KB/FITC-LPS復合物,將LPS或KB/LPS復合物經(jīng)尾靜脈注射C57 BL/6小鼠體內(nèi),分別于注射后1、4、8和24 h采集外周血,分離血漿并檢測FITC-LPS的熒光強度,明確KB對外周血LPS水平的影響;在相同時相點獲取心、肝、脾、肺、腎等臟器并進行組織勻漿,檢測勻漿液中FITC-LPS的熒光強度,明確游離LPS或KB/LPS復合物在小鼠各臟器的分布情況。2.肝臟參與攝取KB/LPS復合物主要細胞類型的研究2.1 C57 BL/6小鼠尾靜脈注射FITC-LPS或KB/FITC-LPS復合物1h后,獲取小鼠肝臟制備組織冰凍切片;分別以Cy3-cytokeration 18、Cy3-F4/80、Cy3-CD31、Cy3-GFAP抗體標記肝細胞(Hepatocytes,HC)、枯否細胞(Kupffer cell,KC)、肝竇內(nèi)皮細胞(Liver sinusoidal endothelial cells,LSEC)、肝星形細胞(Hepatic stellate cells,HSC),利用LSCM檢測肝臟主要細胞與FITC-LPS的共定位情況,確認肝臟參與LPS攝取和代謝的主要細胞類型。2.2尾靜脈注射Clophosome.A.Clodronate liposomes制作KC耗損的小鼠模型,48 h后,獲取肝組織制作冰凍切片,以Cy3-F4/80或Cy3-cytokeration 18抗體分別標記KC或HC,利用LSCM技術(shù)觀察KC的耗損情況。KC耗損小鼠或C57BL/6小鼠經(jīng)尾靜脈注射KB/FITC-LPS復合物,1h后獲取肝組織制作冰凍切片,以Cy3-F4/80或Cy3-cytokeration 18抗體分別標記KC或HC,LSCM檢測肝組織冰凍切片中FITC-LPS的平均熒光強度以及與KC和HC的共定位情況,明確KC是否參與介導肝臟對KB/FITC-LPS復合物的攝取。2.3采用肝原位灌洗,密度梯度離心并結(jié)合免疫磁珠分離,獲取C57 BL/6小鼠原代HC和KC,以人肝腫瘤細胞(Hep G2)或小鼠吞噬細胞(RAW264.7)作為對照細胞株;將上述細胞分別以FITC-LPS或KB/FITC-LPS復合物處理1h,FCM檢測FITC-LPS的攝取,比較分析HC或KC攝取游離LPS和KB/LPS復合物的差異。3.HC參與攝取KB/LPS復合物受體類型的研究3.1實時熒光定量PCR檢測KB對HC中內(nèi)吞相關受體m RNA表達的影響獲取C57 BL/6小鼠原代HC,用LPS(1μg/ml)或KB(15μM)或KB/LPS復合物處理HC 4h,RT-PCR檢測ASGPR、SR-B1、SR-A、TRFC、MARCO、LOX-1和TLR4的m RNA水平,分析HC中可能參與KB或KB/LPS復合物攝取的受體類型。3.2采用蛋白質(zhì)印跡(Western blot,WB)、FCM等分析ASGPR受體與HC攝取KB/LPS復合物的關系(1)獲取C57 BL/6小鼠原代HC,KB(15μM)處理1、2、和4 h,WB檢測HC的ASGPR受體的蛋白表達水平,并與同時相點未處理HC進行比較,分析KB對HC的ASGPR受體表達的影響。(2)C57 BL/6小鼠尾靜脈注射KB(3.6mg/kg),分別于1、2和4h取材,WB檢測肝臟組織ASGPR受體的蛋白表達水平,并與同時相點未處理小鼠進行比較,分析KB對小鼠肝組織的ASGPR受體表達的影響。(3)利用siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)Hep G2的ASGPR受體表達,KB/FITC-LPS復合物處理ASGPR受體下調(diào)后的Hep G2細胞1h,FCM檢測Hep G2攝取FITC-LPS的熒光強度,分析ASGPR受體表達下調(diào)對HC攝取KB/LPS復合物的影響,確認ASGPR受體是否參與HC對KB/LPS復合物的攝取。3.3 LSCM檢測KB與ASGPR受體的空間共定位情況,并結(jié)合競爭性攝取實驗、分子模擬對接,以確認識別并結(jié)合KB是否是ASGPR受體介導KB/LPS復合物攝取的具體方式。(1)獲取C57BL/6小鼠原代HC,FITC-KB(15μM)處理HC 30min,Cy3-ASGPR標記ASGPR受體,LSCM檢測,分析KB與ASGPR受體是否存在空間共定位。(2)獲取C57BL/6小鼠原代HC,FITC-KB(15μM)單獨或與Ga LNAc(0.25、0.5和1.0m M)共同處理細胞1h,LSCM檢測,HC攝取FITC-KB的變化,確認Ga LNAc與KB是否存在競爭被HC攝取的效應。(3)利用分子對接軟件Auto Dock Vina對KB與ASGPR受體H1亞基的結(jié)合位點及結(jié)合力進行模擬;利用Auto Dock Tools GUI在H1亞基的大小為20×18×20埃的空間,以6.46×-4.47×10.41點為中心,且包含碳水化化物識別區(qū)域為構(gòu)象研究對象,分析比對KB與其可能結(jié)合位點及結(jié)合力,并通過軟件Auto Dock Tools和Lig Plot+,對計算結(jié)果進行分析。4.HC降解和清除KB/LPS復合物的分子機制研究獲取TLR4-/-小鼠原代HC,分別以FITC-LPS或FITC-KB對KB/LPS復合物進行示蹤,用KB/LPS復合物處理HC 1h后,分別對HC內(nèi)的早期內(nèi)體(Cy3-EEA1抗體)或晚期內(nèi)體(Cy3-Rab7抗體)或溶酶體(Cy3-LAMP1抗體)及ASGPR受體(Alexa Fluor647-ASGPR抗體)進行標記,LSCM檢測分析KB/LPS復合物是否與ASGPR受體及內(nèi)體或溶酶體存在空間共定位,確認KB/LPS復合物在HC內(nèi)被降解和清除的可能途徑。結(jié)果:1.KB/LPS復合物形成后對LPS在體內(nèi)分布影響的研究血漿檢測結(jié)果顯示,注射FITC-LPS或KB/FITC-LPS復合物后1、4、8和24h,KB+LPS組較LPS組FITC-LPS檢測值顯著下降(P0.01),結(jié)果表明KB/LPS復合物的形成加快了外周血LPS的清除;臟器組織勻漿檢測結(jié)果顯示,在1、4、8和24h,LPS主要分布在肝臟,而心、脾、肺、腎等較少,結(jié)果表明肝臟是參與LPS代謝的主要器官;KB+LPS組較LPS組肝組織內(nèi)FITC-LPS值顯著增加(P0.05);提示,KB/LPS復合物的形成促進了LPS在肝臟的富集。2.肝臟參與攝取KB/LPS復合物主要細胞類型的研究2.1 LSCM檢測結(jié)果表明,肝組織切片中LPS主要分布于HC和KC細胞中,而HSC和LSEC未見明顯的LPS攝取,提示,HC和KC是肝臟參與攝取LPS的主要細胞類型。2.2小鼠經(jīng)尾靜脈注射Clophosome.A.Clodronate liposomes后,可見肝組織切片(Cy3-F4/80)陽性細胞(KC)數(shù)明顯減少,而(Cy3-cytokeration 18)陽性細胞(HC)數(shù)無明顯變化,表明KC耗損;在KC耗損組和未外理組小鼠中,KB/FITC-LPS復合物均可被肝組織攝取,提示,KC耗損與否不影響肝臟攝取KB/LPS復合物,KC可能不是參與攝取KB/LPS復合物的主要細胞。2.3 FCM檢測結(jié)果表明,與LPS組進行比較,KB/LPS復合物形成可顯著促進C57BL/6小鼠HC、Hep G2攝取LPS(P0.05),同時也可顯著抑制了C57 BL/6小鼠KC、RAW264.7攝取LPS(P0.05),提示,結(jié)合型LPS主要依賴HC攝取,游離型LPS主要依賴KC攝取,KB/LPS復合物在肝臟主要被HC攝取。3.HC參與攝取KB/LPS復合物受體類型的研究3.1 RT-PCR檢測結(jié)果表明,與未處理組比較,KB或KB/LPS復合物均可顯著上調(diào)HC的ASGPR受體的m RNA水平(P0.05,P0.01)。3.2 Western blot結(jié)果表明,未經(jīng)KB處理的HC,在體外培養(yǎng)1、2和4h后,ASGPR受體的表達隨時間的延長逐漸減弱;KB處理組HC在1和2 h ASGPR受體蛋白表達水平隨時間延長逐步增加,而4 h則顯著減少。KB注射小鼠肝組織,在1、2和4h,隨時間的延長,ASGPR受體蛋白痕跡帶顏色逐漸加深,而未處理組小鼠,呈逐漸減弱趨勢,結(jié)果表明,KB被HC或肝臟攝取可顯著上調(diào)ASGPR受體蛋白表達水平。FCM檢測,相對熒光強度結(jié)果表明,Hep G2的ASGPR受體蛋白表達下調(diào)可顯著抑制了Hep G2攝取LPS(P0.05,vs NC-siRNA處理組),提示,ASGPR受體參與了HC攝取KB/LPS復合物。3.3 LSCM檢測圖像顯示,KB(綠色)與HC膜上的ASGPR受體(紅色)在HC細胞膜上顯示兩者重合,結(jié)果表明KB與ASGPR受體存在空間共定位,提示,KB可與ASGPR受體結(jié)合。LSCM檢測圖像顯示,隨著Ga LNAc加入量增加,HC內(nèi)攝取的FITC-KB(綠色)熒光物質(zhì)逐漸減少,FITC-KB的平均熒光強度結(jié)果表明,Ga LNAc會顯著抑制HC對KB的攝取(P0.01),提示,Ga LNAc與KB在HC膜上存在共同的介導內(nèi)化途徑。分子對接結(jié)果顯示,KB與ASGPR受體的Asp241、Gln239、Glu252、Asn264、Asn208等氨基酸殘基存在氫鍵結(jié)合,此外,KB還與ASGPR受體的Tyr272、Asp266、Arg270、Trp243、Asn264、Arg236、Thr258等殘基存在疏水作用,提示,KB與ASGPR受體存在結(jié)合作用。4.HC降解和清除KB/LPS復合物的降解清除途徑研究。LSCM檢測圖像顯示,KB/LPS復合物內(nèi)化入HC后,均顯示,FITC-KB(綠色)或FITC-LPS(綠色)在Cy3標記EEA1(紅色)或Cy3標記Rab7(紅色)或Cy3標記LAMP1(紅色)中存在,并與647-ASGPR(黃色)重合,表明,三者存在空間共定位現(xiàn)象;提示,KB/LPS復合物經(jīng)ASGPR受體內(nèi)化入HC后可能由ASGPR受體相關內(nèi)體-溶酶體途徑被降解和清除。結(jié)論:1.KB與LPS形成KB/LPS復合物后加快了小鼠外周血中LPS的清除,該現(xiàn)象與KB促進LPS在肝臟的富集密切相關。2.KB/LPS復合物在肝臟主要被HC攝取,HC對KB/LPS復合物的攝取依賴膜受體ASGPR對KB的識別而介導其內(nèi)化。3.KB/LPS復合物經(jīng)HC膜受體ASGPR介導內(nèi)化后,可能由ASGPR受體相關的內(nèi)體-溶酶體途徑被降解、清除。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R459.7

【參考文獻】

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1 Yong-heng Sui;Wen-jing Luo;Qin-Yu Xu;jing hua;;Dietary saturated fatty acid and polyunsaturated fatty acid oppositely affect hepatic NOD-like receptor protein 3 inflammasome through regulating nuclear factor-kappa B activation[J];World Journal of Gastroenterology;2016年08期

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本文編號：2378027