【摘要】：背景： 自從Asahara等人于1997年第一次從外周循環(huán)血液中分離提取出CD34,后來學者們發(fā)現(xiàn)其有向血管內(nèi)皮細胞分化的趨勢,并能向創(chuàng)傷組織遷移歸巢隨之將其命名為血管內(nèi)皮祖細胞[1],它屬于多能干細胞的一種,定植于骨髓之中,在創(chuàng)傷后向靶區(qū)域遷移并分化成為成熟的血管內(nèi)皮細胞,其表達CD34+/CD133+,這一發(fā)現(xiàn)使人們對血管新生有了一個嶄新的認識,并從血管新生的源頭來思考促進血管再生以及治療缺血性疾病的方法。 近年來,EPCs的生理學特性及臨床應(yīng)用價值越來越多地成為研究的熱點,Warner等發(fā)現(xiàn)在急性心肌梗死的患者中外周血EPCs含量明顯增加,并且其數(shù)量越高,發(fā)生心血管事件的概率及病死率就越低[2],EPCs已成功的在一些缺血性疾病,如肢體缺血性疾病、心血管疾病、原發(fā)性肺動脈高壓等疾病中得到應(yīng)用。其促進血管新生主要有兩個方面的機制：一是可以直接分化為新生血管,二是可分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)來促進這一過程,移植外源性血管內(nèi)皮祖細胞或者使用一些促血管生成的藥物來提高外周血中EPCs的含量,可明顯改善缺血性疾病,尤其是外周血管性疾病以及心血管疾病中患者的預后。但在腦組織缺血,特別是創(chuàng)傷后腦組織缺血中的研究和應(yīng)用卻很少。國內(nèi)外文獻報道了大量關(guān)于外傷后腦梗塞的預后分析與治療經(jīng)驗,證明在創(chuàng)傷后的腦組織中存在缺血與局部循環(huán)障礙,使用促進血管再生的藥物或可改善這一病理過程從而改善預后。 在腦創(chuàng)傷研究領(lǐng)域,研究方向多集中在神經(jīng)再生、腦保護及抑制腦水腫方面,其中血管源性腦水腫(VBE)被公認為是腦創(chuàng)傷及腦出血后最常見的一種腦水腫類型,也是引起腦疝導致死亡的主要原因,血管源性腦水腫的形成大多數(shù)情況下與血腦屏障遭到破壞,毛細血管通透性增加,血漿蛋白及水分滲出增加有關(guān),而這一過程主要集中在局部微循環(huán)中,有學者擔心新生的毛細血管會增加血漿蛋白及水分的滲出從而加重腦水腫的形成,甚至有人嘗試使用抑制血管再生的藥物來緩解創(chuàng)傷后腦組織水腫[4],而療效較常規(guī)脫水、激素、抑肽酶等藥物尚未肯定。反而增加了外傷后腦梗塞形成的風險,以至于學界對腦創(chuàng)傷后是否應(yīng)該使用促血管生成藥物未達成共識。 目的： 1.體外培養(yǎng)和鑒定大鼠外周血來源的EPCs。 2.通過鼠尾靜脈移移植EPCs到腦損傷大鼠,觀察對創(chuàng)傷區(qū)新生血管的影響。 3.測定大鼠腦含水量來估不同組別大鼠腦水腫程度。 4.神經(jīng)功能評分來判斷移植EPCs后血管新生、大鼠腦水腫程度以及預后的相關(guān)性。 方法： 1.EPCs提取、體外培養(yǎng)及鑒定：開胸采集大鼠外周靜脈血,抗凝后梯度離心分離單核細胞,接種于包被纖維連結(jié)蛋白的64孔板,37°貼壁培養(yǎng)培養(yǎng)兩天,每3天換液一次,倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài),CD34+、CD133+、vWF等內(nèi)皮祖細胞標志物的表達,采用熒光素標記的乙酰低密度脂蛋白攝取試驗和荊豆凝集素(FITC-UEA-1)結(jié)合實驗鑒定內(nèi)皮祖細胞功能,流式細胞儀檢測陽性細胞所占比率。 2.大鼠腦損傷模型制作：選用SD成年大鼠120只,分為手術(shù)組和假手術(shù)組,手術(shù)組又分為EPCs組,抑制血管生成組和空白對照組,每組30只。三組均行中度顱腦損傷打擊,創(chuàng)傷后24小時內(nèi),給予EPCs組鼠尾靜脈移植血管內(nèi)皮祖細胞,抑制血管生成組給予局部及鼠尾靜脈注射VEGF抗體,空白對照組鼠尾靜脈注射等量細胞培養(yǎng)液,無菌飼料喂養(yǎng)。 3.神經(jīng)系統(tǒng)評分：每組大鼠每日按改良大鼠神經(jīng)功能評分(：mNSS)評定大鼠神經(jīng)系統(tǒng)損傷及恢復程度。 4.腦水腫程度評估：于第3日、第7日、第14日隨機數(shù)字法從三組大鼠中分別抽取10只,麻醉后升主動脈灌注生理鹽水100ml,斷頭取腦,腦組織稱重,后放入50%蔗糖溶液脫水沉底,再次稱重,二者相減計算出腦組織含水量。 5.血管新生程度觀察：將脫水后的腦組織放入4%多聚甲醛中固定過夜,于創(chuàng)傷區(qū)做連續(xù)石蠟切片,免疫組化CD34+,CD133+染色,鏡下計數(shù)陽性細胞,觀察創(chuàng)傷區(qū)內(nèi)皮血管祖細胞聚集以及血管新生情況。 6.數(shù)據(jù)分析：將mNSS評分所得分數(shù)、腦組織水腫數(shù)據(jù),鏡下陽性細胞計數(shù)數(shù)據(jù)輸入統(tǒng)計分析軟件,判斷其相關(guān)性及是否有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 在腦組織含水量的測定中,EPCs組腦組織平均含水量為(77.26±2.24)%,血管抑制組的腦組織平均含水量為(76.71±1.85)%,空白對照組的腦組織平均含水量為(75.48±1.92)%,三組數(shù)據(jù)差異運用單因素方差分析,LSD檢驗無明顯統(tǒng)計學意義(取P0.05為有統(tǒng)計學意義)。在神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷評分中,EPCs組得分明顯高于其他兩組,而血管抑制組和空白對照組得分差異并無明顯統(tǒng)計學意義。而在CD34+及CD133+免疫組化染色中,EPCs組鏡下計數(shù)的陽性細胞遠多于其他兩組,而統(tǒng)計學分析,鏡下陽性細胞的數(shù)量與預后評分呈正相關(guān),與腦組織含水量無明顯相關(guān)性。 結(jié)論： 1.移植外源性EPCs不會明顯加重創(chuàng)傷腦組織的水腫程度。 2.移植外源性EPCs可明顯增加創(chuàng)傷腦組織新生血管數(shù)量,并促進神經(jīng)再生。 3.移植外源性EPCs可顯著改善腦損傷大鼠預后。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R651.15

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本文編號：2375400