【摘要】：第一部分Protectin DX對膿毒癥小鼠的生存率以及多器官損傷的影響目的：探討不同劑量Protectin DX (PDX)對膿毒癥小鼠生存率以及重要器官損傷的影響。方法：第一部分：建立小鼠膿毒癥模型,觀察不同劑量Protectin DX對膿毒癥小鼠生存率的影響。采用盲腸結(jié)扎穿孔術(cecal ligation and puncture, CLP)建立小鼠膿毒癥模型：60只雄性C57BL/6J小鼠隨機分為5組,每組各12只小鼠。(1)Sham組：小鼠行假手術,術后1h腹腔注射100μl生理鹽水：(2)CLP組：小鼠行CLP術,術后1h腹腔注射100μl生理鹽水;(3)CLP+ 100ng PDX組：小鼠行CLP術,術后1h腹腔注射100ng PDX; (4) CLP+300ng PDX組：小鼠行CLP術,術后1h腹腔注射300ng PDX; (5)CLP+1000ng PDX組：小鼠行CLP術,術后1h腹腔注射1000ngPDX;術后每24小時記錄一次小鼠死亡數(shù)量,直至術后第八天。第二部分：探討PDX對膿毒癥小鼠重要器官損傷以及全身炎癥反應的影響。30只雄性C57BL/6J小鼠隨機分三組：(1)Sham組：小鼠行假手術,術后1h腹腔注射100μ1生理鹽水：(2)CLP組：小鼠行CLP手術,術后1h腹腔注射100μl生理鹽水;(3) CLP+PDX組：小鼠行CLP術,術后1h腹腔注射300ng PDX。在術后24小時處死小鼠,取小鼠肺、肝、腎等重要器官以及外周血和腹腔灌洗液(peritoneal lavage fluid, PLF)。采用HE染色評估肺、腎、肝等重要器官的組織病理損傷：采用生化分析儀檢測血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase, AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)、肌酐(creatinine, Cr)及尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)水平。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清和PLF中炎癥因子(TNF-α,IL-6,MCP-1和IL-10)水平。結(jié)果：(1)CLP誘導的膿毒癥小鼠8天生存率為25%;PDX300ng和1000ng可分別提高膿毒癥小鼠8天生存率至66.7%和75%；PDX100ng組8天生存率為41.67%,和CLP組相比,差異無統(tǒng)計學意義。(2)CLP組中小鼠肺、腎、肝等器官明顯損傷,病理學評分顯著降低；血清中ALT、AST、Cr和BUN水平明顯增高；血清和PLF中的炎癥因子(TNF-α,IL-6,MCP-1、IL-10)水平均明顯升高；PDX300ng明顯減輕CLP誘導的重要器官(肺、腎、肝)損傷；降低血清中ALT、AST、Cr和BUN水平：降低血清和PLB中促炎因子(TNF-α、IL-6、 MCP-1)水平,提高抑炎因子IL-10水平。結(jié)論：PDX可明顯提高膿毒癥小鼠生存率,減輕膿毒癥引起的重要器官損傷并降低全身和局部炎癥因子水平。第二部分PDX調(diào)節(jié)腹腔巨噬細胞分型促進膿毒癥小鼠炎癥消退目的：探討PDX對膿毒癥小鼠腹腔巨噬細胞分型以及吞噬功能的影響。方法：C57BL/6J小鼠隨機分為三組,每組各7只小鼠：(1) sham組：小鼠行假手術,術后1h腹腔注射100μl生理鹽水；(2)CLP組：小鼠行CLP術,術后1h腹腔注射100μl生理鹽水;(3) CLP+ PDX組：小鼠行CLP術,術后1h腹腔注射300ng PDX。術后24小時處死小鼠,取小鼠外周血和腹腔灌洗液(PLB)做相關檢測。采用血培養(yǎng)板檢測小鼠外周血和PLF中細菌負荷；吉姆薩(Giemsa)染色法觀察PLF中中性粒細胞和單核／巨噬細胞數(shù)目的變化：流式細胞學檢測PLF中巨噬細胞M1和M2分型情況以及巨噬細胞吞噬功能：Western Blot檢測PLF中巨噬細胞M2型標志物精氨酸酶-1(Arginase 1,Argl)和幾丁質(zhì)酶-3樣蛋白-3(Chitinase 3-like 3,Argl)以及過氧化物酶增殖活化受體-gamma (peroxisome proliferator-activated receptor-y, PPAR-y)的表達水平。結(jié)果：與對照組相比,CLP組小鼠外周血及PLF中培養(yǎng)出大量細菌負荷,PBL中白細胞總數(shù),中性粒細胞數(shù)目和單核巨噬細胞數(shù)目顯著增加,巨噬細胞吞噬活性增強;PLF中M1型巨噬細胞增多,M2型巨噬細胞減少：巨噬細胞表達Argl、Argl和PPAR-γ水平降低。給予PDX處理明顯減少膿毒癥小鼠外周血及PBL中的細菌負荷,減少PLF中性粒細胞數(shù)量,增加單核巨噬細胞與中性粒細胞比例；增強巨噬細胞吞噬活性增強。與CLP組相比,PDX組小鼠PLF中M1型巨噬細胞減少,M2型巨噬細胞顯著增多；并且PLF中巨噬細胞表達Argl、Argl和PPAR-γ水平明顯增高。結(jié)論：PDX通過調(diào)節(jié)腹腔巨噬細胞向M2極化,增強巨噬細胞吞噬功能,從而降低全身和局部細菌負荷,促進炎癥消退增加。第三部分PDX誘導小鼠巨噬細胞系RAW264.7向M2型巨噬細胞極化目的：研究PDX對小鼠巨噬細胞系RAW264.7極化的影響以及相關信號通路。方法：第一部分：觀察不同劑量PDX對RAW264.7極化的影響。將RAW264.7細胞系隨機分為4組：(1)對照組：加入PDX的溶劑作為對照；(2)PDX(10nM)組：加入PDX使其終濃度為10nM；(3)PDX(100nM)組：加入PDX使其終濃度為100nM; (4)PDX(1000nM)組：加入PDX使其終濃度為1000nM;Western blot和免疫熒光檢測RAW264.7細胞的M2型巨噬細胞標志物(Arg1和Ym1)以及PPARγ表達水平;第二部分；探討PDX誘導RAW264.7細胞向M2型極化的信號通路。將RAW264.7細胞系隨機分為4組：(1)對照組：加入PDX的溶劑作為對照：(2)PDX(100nM)組：加入PDX使其終濃度為100nM;(3)PDX(1000nM)組：加入PDX使其終濃度為1000nM; (4)PDX+ GW9662組：在加入終濃度為1000nM PDX處理前30min加PPARγ阻斷劑GW9662 1μM。 Western blot和免疫熒光檢測RAW264.7細胞的M2型標志物(Argl和Ym1)以及即ARγ表達水平。結(jié)果：PDX刺激引起RAW264.7細胞M2標志物Arg1和Yml表達增多,以及PPARγ表達上調(diào)。阻斷PPARγ表達可以消除PDX誘導的M2型標志物Arg1和Yml表達增多結(jié)論：PDX可以誘導細胞RAW264.7細胞向M2巨噬細胞極化,其作用是通過激活PPARy信號通路實現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R459.7

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本文編號：2361659