【摘要】：膿毒性腦病(sepsis-associated encephalopathy,SAE)是感染后全身炎癥反應所致的彌漫性大腦功能障礙和意識改變,是多臟器功能不全綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)的重要組成部分及患者預后不良的獨立危險因素。SAE的病因和病理機制非常復雜,以白細胞浸潤、神經(jīng)元細胞變性壞死、星型膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞激活為標志的炎癥反應起到了重要的作用。其中星形膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后呈現(xiàn)保護或毒性作用的“雙相”性及活化的時空性特點和SAE的臨床表現(xiàn)有很好的契合性。星形細胞激活后出現(xiàn)反應性膠質(zhì)化(reactive gliosis)、增殖遷移等狀態(tài),胞內(nèi)游離ca2+濃度的升高起了重要作用。星形細胞過度活化可誘發(fā)凋亡,其中定位于線粒體參與非Caspase依賴凋亡途徑的BNIP3/AIF/EndoG通路介導神經(jīng)凋亡亦被證實和鈣超載有關。瞬時感受器電位M2型(Transient Receptor Potential2Channels,TRPM2)通道是位于細胞膜上的一種多功能鈣離子通透性的非選擇性陽離子通道,通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子濃度可以調(diào)節(jié)氧化應激或再灌注等病理損傷中的細胞死亡。TRPM2通道很可能參與調(diào)節(jié)了LPS誘導的星形膠質(zhì)細胞的活化和凋亡。本研究通過建立LPS腹腔注射致小鼠腦內(nèi)炎癥的模型及引入[RPM2基因敲除小鼠,研究膿毒癥在小鼠腦內(nèi)的炎癥改變及星形膠質(zhì)細胞增殖和膠質(zhì)化的時間規(guī)律,TRPM2在LPS致炎小鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細胞增殖和膠質(zhì)化的調(diào)節(jié)作用及參與BNIP3/AIF/EndoG介導LPS致炎小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞的凋亡；以及通過星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)及TRPM2-siRNA轉(zhuǎn)染,進一步研究LPS是否可以誘導星形膠質(zhì)細胞的適應性表達,以及TRPM2-siRNA轉(zhuǎn)染是否可以有效抑制LPS誘導的體外星形膠質(zhì)細胞的活化和致炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌。從而明確星形膠質(zhì)細胞TRPM2通道與膿毒性腦病的關系和分子機制,期待為防治膿毒癥及膿毒性腦病提供理論依據(jù)。 目的： 研究LPS致炎后野生型和基因敲除(TRPM2)小鼠的一般行為學、腦內(nèi)炎癥改變、星形膠質(zhì)細胞活化、促炎因子分泌及凋亡的差異；同時研究LPS誘導后星形膠質(zhì)細胞TRPM2的表達特點及基因沉默后的差異,探討LPS致炎對小鼠星形膠質(zhì)細胞的活化影響、誘導TRPM2的適應性表達及TRPM2通道在星形膠質(zhì)細胞活化中的作用及對神經(jīng)細胞凋亡的影響。 方法： 1.動物模型：成年雄性C57BL/6小鼠野生型小鼠分別腹腔注射LPS5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg;對照組注入等量生理鹽水。監(jiān)測小鼠體溫、神經(jīng)行為學改變、驚厥發(fā)作、攝食改變及死亡率；24h后取腦HE染色觀察神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞病理變化特點和觀察腦膜、腦室及腦實質(zhì)炎癥反應；免疫熒光檢測小鼠海馬區(qū)GFAP陽性細胞數(shù)量；TUNEL法檢測小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡。 2.在體實驗：成年雄性C57BL/6小鼠野生型及同種系TRPM2小鼠分別腹腔注射LPS50mg/kg,對照組注入等量生理鹽水,監(jiān)測小鼠一般神經(jīng)行為學改變、死亡率；并于注射后12h,24h,48h時間點取小鼠腦組織,通過免疫組化、Western blot方法檢測LPS致炎后12h,24h,48h時間點野生型及TRPM2小鼠大腦海馬區(qū)GFAP和TRPM2的表達變化和差異；熒光定量RT-PCR技術檢測不同實驗組小鼠腦組織TNF-a, IL-1β,IL-6mRNA的表達變化；Western blot方法檢測海馬BNIP3/AIF/EndoG的蛋白質(zhì)表達變化。 3.離體實驗：培養(yǎng)純化鑒定小鼠星形膠質(zhì)細胞；MTT法檢測不同濃度(LPS: Oμg/ml,1.0μg/ml,3.0μg/ml,5.0μg/ml,7.0μg/ml,10.0μg/ml,12.0μg/ml,15.0μg/ml)及不同時間(2h,6h,12h,24h,2d及3d)LPS刺激后星形膠質(zhì)細胞存活率；免疫熒光法檢測星形膠質(zhì)細胞GFAP的表達,熒光定量RT-PCR法檢測TRPM2-mRNA的表達,Western blot方法檢測TRPM2蛋白的表達,ELISA法檢測星形細胞培養(yǎng)液細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)濃度變化。以75ng TRPM2-siRNA和3μl HiPerFect Transfection Reagent轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細胞進行基因沉默,以10.0μg/ml LPS分別誘導細胞0h、24h、48h后,熒光定量RT-PCR技術檢測小鼠星形膠質(zhì)細胞上TRPM2mRNA表達水平的變化,Western blot方法檢測TRPM2蛋白表達,ELISA法檢測星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液細胞因子(TNF-a, IL-1β, IL-6)濃度。 結果： 1.小鼠LPS腹腔注射后有相應體溫改變,出現(xiàn)相應神經(jīng)行為學改變及驚厥發(fā)作、拒食現(xiàn)象以及死亡,均較對照組明顯,其中LPS (50mg/kg)腹腔注射組死亡率達到33.3%；LPS致炎后小鼠腦內(nèi)出現(xiàn)典型炎癥性病理改變,TUNEL結果還發(fā)現(xiàn)小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象較對照組顯著(P0.05)；隨著LPS刺激劑量增加小鼠海馬區(qū)GFAP陽性細胞數(shù)顯著增加,細胞胞漿明顯增加、突起增多(P0.05)。 2.野生型小鼠海馬區(qū)GFAP陽性細胞數(shù)與TRPM2表達在膿毒癥腦損傷后顯著增加,LPS致炎野生型(L組)GFAP與TRPM2表達在12h即有增多,24h達到高峰,48h略有減少,均較生理鹽水對照組(S組)顯著增多(P0.05)。LPS致炎后TRPM2基因敲除小鼠較野生型病死率增加,一般神經(jīng)行為學指標改善。 TRPM2基因敲除小鼠GFAP表達在膿毒癥腦損傷后顯著降低,TRPM2基因敲除LPS致炎組(KO/L組)小鼠海馬區(qū)GFAP陽性細胞較野生型LPS致炎組(L組)顯著減少(P0.05)。小鼠海馬區(qū)可見GFAP細胞與TRPM2細胞有共聚現(xiàn)象。 LPS致炎后24h TRPM2基因敲除較野生型小鼠腦組織TNF-α,IL-1β, IL-6mRNA的表達下降。 膿毒癥腦損傷后4個實驗組小鼠海馬區(qū)BNIP3(F(3.16)=176.53, P0.01、AIF (F(3.16)=98.61, P0.01)\EndoG (F(3,16)=60.55, p0.01)表達均有顯著性差異。BNIP3蛋白質(zhì)表達L組較S組顯著增加(P0.05),KO/L組較KO/S組(P0.05)和L組(P0.05)均顯著降低,S組與KO/S組比較無統(tǒng)計學差異(P0.05)。AIF蛋白質(zhì)表達L組較S組顯著增加(P0.05),KO/L組較KO/S組(P0.05)和L組(P0.05)均顯著降低。Endo G蛋白質(zhì)表達L組較S組顯著增加(P0.05),KO/L組較L組顯著降低(P0.05),S組與KO/S組比較無統(tǒng)計學差異(P0.05)。 3.不同濃度LPS刺激24h后星形膠質(zhì)細胞存活率差異具有統(tǒng)計學意義(F(7,72)=9.39,P0.01)；持續(xù)刺激24h后10.0μg/ml濃度的LPS是星形膠質(zhì)細胞增殖活性的臨界點。不同刺激時間點的星形膠質(zhì)細胞存活率差異具有統(tǒng)計學意義(F(1,18)=6.41,P0.05),早期隨著LPS刺激時間的延長,星形膠質(zhì)細胞增殖活性逐漸增加,且刺激24h時達高峰,在LPS刺激48h以后星形膠質(zhì)細胞增殖活性明顯降低,至72h達到最低。故10.0μg/ml濃度LPS刺激48h是星形膠質(zhì)細胞從增殖轉(zhuǎn)向凋亡的臨界點。 LPS不同刺激時間點星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液中細胞因子TNF-a (F(1.18)=66.21, P0.01)、IL-1β(F(1.18)=430.76, P0.01)、IL-6(F(1.18)=12725.06, P0.01的濃度變化具有統(tǒng)計學意義。LPS刺激12h后培養(yǎng)液中TNF-a濃度顯著上升,6h后IL-1β濃度顯著上升,2h后IL-6濃度顯著上升。LPS能誘導星形膠質(zhì)細胞TRPM2mRNA和TRPM2蛋白表達顯著增加(P0.05)。 TRPM2-siRNA轉(zhuǎn)染能顯著降低星形膠質(zhì)細胞TRPM2mRNA和TRPM2蛋白表達(P0.05)。TRPM2-siRNA轉(zhuǎn)染后細胞GFAP蛋白表達顯著低于非轉(zhuǎn)染組細胞GFAP蛋白表達(P0.05)。TRPM2-siRNA轉(zhuǎn)染能抑制LPS誘導星形膠質(zhì)細胞分泌TNF-a, IL-1β和IL-6。LPS+TRPM2-siRNA組TNF-a, IL-1β和IL-6濃度較LPS組均顯著降低(P0.05)。 結論： 1.小鼠LPS (50mg/kg)腹腔注射建�？烧T發(fā)明顯的腦內(nèi)炎癥和神經(jīng)行為學改變,并最接近臨床膿毒癥標準。 2.LPS可誘導星形膠質(zhì)細胞增殖、膠質(zhì)化及凋亡,并在時間上有一定的規(guī)律性；LPS可誘導星形膠質(zhì)細胞TRPM2-mRNA和TRPM2蛋白的表達,這種表達在星形膠質(zhì)細胞屬于適應性表達；TRPM2通道參與LPS致炎小鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細胞增殖和膠質(zhì)化調(diào)節(jié)、星形膠質(zhì)細胞致炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6分泌調(diào)節(jié)及可能參與了BNIP3/AIF/EndoG介導的LPS致炎小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡。 3.PRPM2-siRNA轉(zhuǎn)染基因沉默后可以有效抑制LPS誘導的體外星形膠質(zhì)細胞TRPM2-mRNA和TRPM2蛋白的表達；抑制LPS誘導的體外星形膠質(zhì)細胞的活化和致炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R459.7

【共引文獻】

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本文編號：2361210