【摘要】：膿毒性腦病(sepsis-associated encephalopathy,SAE)是感染后全身炎癥反應(yīng)所致的彌漫性大腦功能障礙和意識改變,是多臟器功能不全綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)的重要組成部分及患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。SAE的病因和病理機(jī)制非常復(fù)雜,以白細(xì)胞浸潤、神經(jīng)元細(xì)胞變性壞死、星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活為標(biāo)志的炎癥反應(yīng)起到了重要的作用。其中星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后呈現(xiàn)保護(hù)或毒性作用的“雙相”性及活化的時(shí)空性特點(diǎn)和SAE的臨床表現(xiàn)有很好的契合性。星形細(xì)胞激活后出現(xiàn)反應(yīng)性膠質(zhì)化(reactive gliosis)、增殖遷移等狀態(tài),胞內(nèi)游離ca2+濃度的升高起了重要作用。星形細(xì)胞過度活化可誘發(fā)凋亡,其中定位于線粒體參與非Caspase依賴凋亡途徑的BNIP3/AIF/EndoG通路介導(dǎo)神經(jīng)凋亡亦被證實(shí)和鈣超載有關(guān)。瞬時(shí)感受器電位M2型(Transient Receptor Potential2Channels,TRPM2)通道是位于細(xì)胞膜上的一種多功能鈣離子通透性的非選擇性陽離子通道,通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子濃度可以調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激或再灌注等病理損傷中的細(xì)胞死亡。TRPM2通道很可能參與調(diào)節(jié)了LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和凋亡。本研究通過建立LPS腹腔注射致小鼠腦內(nèi)炎癥的模型及引入[RPM2基因敲除小鼠,研究膿毒癥在小鼠腦內(nèi)的炎癥改變及星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和膠質(zhì)化的時(shí)間規(guī)律,TRPM2在LPS致炎小鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和膠質(zhì)化的調(diào)節(jié)作用及參與BNIP3/AIF/EndoG介導(dǎo)LPS致炎小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡；以及通過星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及TRPM2-siRNA轉(zhuǎn)染,進(jìn)一步研究LPS是否可以誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的適應(yīng)性表達(dá),以及TRPM2-siRNA轉(zhuǎn)染是否可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的體外星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和致炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌。從而明確星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPM2通道與膿毒性腦病的關(guān)系和分子機(jī)制,期待為防治膿毒癥及膿毒性腦病提供理論依據(jù)。 目的： 研究LPS致炎后野生型和基因敲除(TRPM2)小鼠的一般行為學(xué)、腦內(nèi)炎癥改變、星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、促炎因子分泌及凋亡的差異；同時(shí)研究LPS誘導(dǎo)后星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPM2的表達(dá)特點(diǎn)及基因沉默后的差異,探討LPS致炎對小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化影響、誘導(dǎo)TRPM2的適應(yīng)性表達(dá)及TRPM2通道在星形膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用及對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。 方法： 1.動物模型：成年雄性C57BL/6小鼠野生型小鼠分別腹腔注射LPS5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg;對照組注入等量生理鹽水。監(jiān)測小鼠體溫、神經(jīng)行為學(xué)改變、驚厥發(fā)作、攝食改變及死亡率；24h后取腦HE染色觀察神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞病理變化特點(diǎn)和觀察腦膜、腦室及腦實(shí)質(zhì)炎癥反應(yīng)；免疫熒光檢測小鼠海馬區(qū)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量；TUNEL法檢測小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。 2.在體實(shí)驗(yàn)：成年雄性C57BL/6小鼠野生型及同種系TRPM2小鼠分別腹腔注射LPS50mg/kg,對照組注入等量生理鹽水,監(jiān)測小鼠一般神經(jīng)行為學(xué)改變、死亡率；并于注射后12h,24h,48h時(shí)間點(diǎn)取小鼠腦組織,通過免疫組化、Western blot方法檢測LPS致炎后12h,24h,48h時(shí)間點(diǎn)野生型及TRPM2小鼠大腦海馬區(qū)GFAP和TRPM2的表達(dá)變化和差異；熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測不同實(shí)驗(yàn)組小鼠腦組織TNF-a, IL-1β,IL-6mRNA的表達(dá)變化；Western blot方法檢測海馬BNIP3/AIF/EndoG的蛋白質(zhì)表達(dá)變化。 3.離體實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)純化鑒定小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞；MTT法檢測不同濃度(LPS: Oμg/ml,1.0μg/ml,3.0μg/ml,5.0μg/ml,7.0μg/ml,10.0μg/ml,12.0μg/ml,15.0μg/ml)及不同時(shí)間(2h,6h,12h,24h,2d及3d)LPS刺激后星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率；免疫熒光法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的表達(dá),熒光定量RT-PCR法檢測TRPM2-mRNA的表達(dá),Western blot方法檢測TRPM2蛋白的表達(dá),ELISA法檢測星形細(xì)胞培養(yǎng)液細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)濃度變化。以75ng TRPM2-siRNA和3μl HiPerFect Transfection Reagent轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行基因沉默,以10.0μg/ml LPS分別誘導(dǎo)細(xì)胞0h、24h、48h后,熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞上TRPM2mRNA表達(dá)水平的變化,Western blot方法檢測TRPM2蛋白表達(dá),ELISA法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液細(xì)胞因子(TNF-a, IL-1β, IL-6)濃度。 結(jié)果： 1.小鼠LPS腹腔注射后有相應(yīng)體溫改變,出現(xiàn)相應(yīng)神經(jīng)行為學(xué)改變及驚厥發(fā)作、拒食現(xiàn)象以及死亡,均較對照組明顯,其中LPS (50mg/kg)腹腔注射組死亡率達(dá)到33.3%；LPS致炎后小鼠腦內(nèi)出現(xiàn)典型炎癥性病理改變,TUNEL結(jié)果還發(fā)現(xiàn)小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象較對照組顯著(P0.05)；隨著LPS刺激劑量增加小鼠海馬區(qū)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加,細(xì)胞胞漿明顯增加、突起增多(P0.05)。 2.野生型小鼠海馬區(qū)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)與TRPM2表達(dá)在膿毒癥腦損傷后顯著增加,LPS致炎野生型(L組)GFAP與TRPM2表達(dá)在12h即有增多,24h達(dá)到高峰,48h略有減少,均較生理鹽水對照組(S組)顯著增多(P0.05)。LPS致炎后TRPM2基因敲除小鼠較野生型病死率增加,一般神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)改善。 TRPM2基因敲除小鼠GFAP表達(dá)在膿毒癥腦損傷后顯著降低,TRPM2基因敲除LPS致炎組(KO/L組)小鼠海馬區(qū)GFAP陽性細(xì)胞較野生型LPS致炎組(L組)顯著減少(P0.05)。小鼠海馬區(qū)可見GFAP細(xì)胞與TRPM2細(xì)胞有共聚現(xiàn)象。 LPS致炎后24h TRPM2基因敲除較野生型小鼠腦組織TNF-α,IL-1β, IL-6mRNA的表達(dá)下降。 膿毒癥腦損傷后4個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠海馬區(qū)BNIP3(F(3.16)=176.53, P0.01、AIF (F(3.16)=98.61, P0.01)\EndoG (F(3,16)=60.55, p0.01)表達(dá)均有顯著性差異。BNIP3蛋白質(zhì)表達(dá)L組較S組顯著增加(P0.05),KO/L組較KO/S組(P0.05)和L組(P0.05)均顯著降低,S組與KO/S組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。AIF蛋白質(zhì)表達(dá)L組較S組顯著增加(P0.05),KO/L組較KO/S組(P0.05)和L組(P0.05)均顯著降低。Endo G蛋白質(zhì)表達(dá)L組較S組顯著增加(P0.05),KO/L組較L組顯著降低(P0.05),S組與KO/S組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 3.不同濃度LPS刺激24h后星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F(7,72)=9.39,P0.01)；持續(xù)刺激24h后10.0μg/ml濃度的LPS是星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖活性的臨界點(diǎn)。不同刺激時(shí)間點(diǎn)的星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F(1,18)=6.41,P0.05),早期隨著LPS刺激時(shí)間的延長,星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖活性逐漸增加,且刺激24h時(shí)達(dá)高峰,在LPS刺激48h以后星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖活性明顯降低,至72h達(dá)到最低。故10.0μg/ml濃度LPS刺激48h是星形膠質(zhì)細(xì)胞從增殖轉(zhuǎn)向凋亡的臨界點(diǎn)。 LPS不同刺激時(shí)間點(diǎn)星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子TNF-a (F(1.18)=66.21, P0.01)、IL-1β(F(1.18)=430.76, P0.01)、IL-6(F(1.18)=12725.06, P0.01的濃度變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LPS刺激12h后培養(yǎng)液中TNF-a濃度顯著上升,6h后IL-1β濃度顯著上升,2h后IL-6濃度顯著上升。LPS能誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPM2mRNA和TRPM2蛋白表達(dá)顯著增加(P0.05)。 TRPM2-siRNA轉(zhuǎn)染能顯著降低星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPM2mRNA和TRPM2蛋白表達(dá)(P0.05)。TRPM2-siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞GFAP蛋白表達(dá)顯著低于非轉(zhuǎn)染組細(xì)胞GFAP蛋白表達(dá)(P0.05)。TRPM2-siRNA轉(zhuǎn)染能抑制LPS誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-a, IL-1β和IL-6。LPS+TRPM2-siRNA組TNF-a, IL-1β和IL-6濃度較LPS組均顯著降低(P0.05)。 結(jié)論： 1.小鼠LPS (50mg/kg)腹腔注射建�？烧T發(fā)明顯的腦內(nèi)炎癥和神經(jīng)行為學(xué)改變,并最接近臨床膿毒癥標(biāo)準(zhǔn)。 2.LPS可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、膠質(zhì)化及凋亡,并在時(shí)間上有一定的規(guī)律性；LPS可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPM2-mRNA和TRPM2蛋白的表達(dá),這種表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞屬于適應(yīng)性表達(dá)；TRPM2通道參與LPS致炎小鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和膠質(zhì)化調(diào)節(jié)、星形膠質(zhì)細(xì)胞致炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6分泌調(diào)節(jié)及可能參與了BNIP3/AIF/EndoG介導(dǎo)的LPS致炎小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。 3.PRPM2-siRNA轉(zhuǎn)染基因沉默后可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的體外星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPM2-mRNA和TRPM2蛋白的表達(dá)；抑制LPS誘導(dǎo)的體外星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和致炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R459.7

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2361210