【摘要】：研究目的失血性休克常見于創(chuàng)傷和大手術(shù),可以造成缺血/再灌注類型的損傷。失血性休克患者在接受二次打擊如感染時(shí),更易發(fā)展為系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)和多器官功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome,MOF)。研究表明失血性休克可以通過預(yù)激活固有免疫系統(tǒng),放大炎癥反應(yīng),導(dǎo)致組織、器官損傷,然而其具體機(jī)制未明。并且在失血性休克的發(fā)展過程中巨噬細(xì)胞與中性粒細(xì)胞間的相互作用并不清楚,越來越多的研究表明外泌體可以介導(dǎo)細(xì)胞間的交流。我們通過對(duì)失血性休克過程中巨噬細(xì)胞對(duì)中性粒細(xì)胞死亡調(diào)控的研究,以探索失血性休克的發(fā)展機(jī)制,以期改善對(duì)手術(shù)、創(chuàng)傷病人致失血性休克的臨床干預(yù)。研究方法1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用失血性休克模型,將C57BL/6野生型、gp91基因敲除型小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、失血性休克組(HS組)。對(duì)Sham組小鼠不抽取血液、不進(jìn)行復(fù)蘇,其余實(shí)驗(yàn)步驟與HS組相同。為了研究肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)中性粒細(xì)胞死亡的作用,在失血性休克前24小時(shí)于氣管內(nèi)注射Clodrosme以清除肺泡巨噬細(xì)胞。復(fù)蘇8小時(shí)后,處死小鼠,實(shí)施肺泡灌洗,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.體外實(shí)驗(yàn)采用低氧/復(fù)氧培養(yǎng)條件下巨噬細(xì)胞與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)模型。低氧條件為在1%O2下培養(yǎng)15小時(shí),在21%O2下培養(yǎng)5小時(shí)。對(duì)照組即為在21%O2下培養(yǎng)20小時(shí)。巨噬細(xì)胞與中性粒細(xì)胞均從小鼠骨髓提取,巨噬細(xì)胞在體外培養(yǎng)成熟后與中性粒細(xì)胞按1:1比例共培養(yǎng)。3.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肺泡灌洗液中和體外共培養(yǎng)后中性粒細(xì)胞7-AAD和Annexin V雙陽性細(xì)胞所占的比例;用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)中性粒細(xì)胞內(nèi)RIPK1與RIPK3共定位情況;通過Western-Blot檢測(cè)中性粒細(xì)胞內(nèi)RIPK1與MLKL磷酸化情況。以上檢測(cè)方法聯(lián)合使用可以判斷中性粒細(xì)胞是否處于壞死狀態(tài)。4.采用外泌體分離試劑盒(培養(yǎng)基專用)分離細(xì)胞培養(yǎng)基中的外泌體。用NTA檢測(cè)外泌體的大小,Lowry法對(duì)外泌體中蛋白進(jìn)行定量,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外泌體標(biāo)志物CD63的表達(dá)情況,電鏡下觀察外泌體的典型形態(tài)。研究結(jié)果1.在失血性休克模型中巨噬細(xì)胞促進(jìn)中性粒細(xì)胞壞死。與假手術(shù)組(Sham組)相比,失血性休克組(HS組)肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞7-aad和annexinv雙陽性所占的比例明顯升高(p0.01)。clodrosome氣管內(nèi)注射后(clodrosome-hs組)肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞7-aad和annexinv雙陽性所占的比例較hs組明顯降低(p0.01)。通過激光共聚焦顯微鏡同樣檢測(cè)到hs組肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞內(nèi)ripk1與ripk3共定位明顯增多;clodrosome清除肺泡巨噬細(xì)胞后,中性粒細(xì)胞內(nèi)ripk1與ripk3共定位相較于hs組減少(p0.01)。2.在低氧/復(fù)氧模型中巨噬細(xì)胞促進(jìn)中性粒細(xì)胞壞死。在低氧條件下與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組(hypoxia+mφ組)中性粒細(xì)胞7-aad和annexinv雙陽性所占的比例較其它組明顯增高(p0.01),ripk1抑制劑nec-1可以抑制hypoxia+mφ組中性粒細(xì)胞壞死的增加(p0.01)。westernblot檢測(cè)到hypoxia+mφ組中性粒細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的ripk1磷酸化條帶。通過激光共聚焦顯微鏡可以看到hypoxia+mφ組中性粒細(xì)胞內(nèi)ripk1與ripk3共定位增加(p0.01)。3.在失血性休克模型中巨噬細(xì)胞釋放外泌體增加。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺泡灌洗液中外泌體標(biāo)志物cd63平均熒光強(qiáng)度(mfi)。與假手術(shù)組(sham組)相比,失血性休克組(hs組)mfi明顯增高(p0.01);清除肺泡巨噬細(xì)胞后,外泌體含量較hs組減少(p0.01)。通過透射電鏡可以觀測(cè)到外泌體的雙層膜結(jié)構(gòu)。4.在體外低氧/復(fù)氧模型中巨噬細(xì)胞外泌體分泌增加。用納米顆粒分析系統(tǒng)(nta)檢測(cè)我們自培養(yǎng)基中分離的外泌體,其平均直徑為39.86nm,占全部分離顆粒的85%。低氧培養(yǎng)條件下巨噬細(xì)胞分泌外泌體內(nèi)蛋白含量為正常氧培養(yǎng)條件下的(4.16±0.35)倍(p0.01)。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞外泌體標(biāo)志物cd63表達(dá)強(qiáng)弱,低氧培養(yǎng)條件下巨噬細(xì)胞分泌外泌體表達(dá)cd63的平均熒光強(qiáng)度(mfi)較正常氧培養(yǎng)條件下明顯增高(p=0.009)。且激光共聚焦顯微鏡下可以觀察到中性粒細(xì)胞內(nèi)攝取有巨噬細(xì)胞分泌的外泌體。5.外泌體分泌抑制劑能夠抑制低氧/復(fù)氧過程中巨噬細(xì)胞對(duì)中性粒細(xì)胞壞死的促進(jìn)作用。外泌體分泌抑制劑dma能夠抑制低氧/復(fù)氧條件下與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后(hypoxia+mφ+dma組)中性粒細(xì)胞7-aad和annexinv雙陽性細(xì)胞比例的增加,與hypoxia+mφ組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。westernblot檢測(cè)到在低氧/復(fù)氧條件下與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后,dma可以抑制中性粒細(xì)胞內(nèi)ripk1、mlkl磷酸化。通過激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)到dma可以抑制低氧/復(fù)氧條件下巨噬細(xì)胞促進(jìn)的中性粒細(xì)胞內(nèi)ripk1與ripk3共定位。6.低氧/復(fù)氧過程中巨噬細(xì)胞釋放外泌體促進(jìn)中性粒細(xì)胞壞死。與低氧培養(yǎng)條件下巨噬細(xì)胞分泌的外泌體共培養(yǎng)組(hypoxia+exos組)中性粒細(xì)胞壞死水平較與正常氧培養(yǎng)條件下巨噬細(xì)胞分泌的外泌體共培養(yǎng)組(Normoxia+Exos組)明顯增加,且能為Nec-1所抑制(P0.01)。7.在低氧/復(fù)氧模型中巨噬細(xì)胞外泌體上調(diào)中性粒細(xì)胞內(nèi)ROS水平。在低氧條件下與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組(Hypoxia+Mφ組)中性粒細(xì)胞內(nèi)ROS水平較其它組明顯升高(P0.01),且能被外泌體分泌抑制劑DMA所抑制。并且,與低氧培養(yǎng)條件下巨噬細(xì)胞分泌的外泌體共培養(yǎng)組(Hypoxia+Exos組)中性粒細(xì)胞內(nèi)ROS水平較與正常氧培養(yǎng)條件下巨噬細(xì)胞分泌的外泌體共培養(yǎng)組(Normoxia+Exos組)明顯增加(P0.01)。8.低氧/復(fù)氧過程中巨噬細(xì)胞外泌體通過上調(diào)中性粒細(xì)胞內(nèi)ROS水平促進(jìn)其壞死。低氧培養(yǎng)條件下與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)加入ROS清除劑NAC后(Hypoxia+Mφ+NAC組),中性粒細(xì)胞7-AAD和Annexin V雙陽性所較Hypoxia+Mφ組明顯下降(P0.01)。WT中性粒細(xì)胞與gp~(91~(phox-/-))巨噬細(xì)胞在低氧條件下共培養(yǎng)后,中性粒細(xì)胞壞死比例與中性粒細(xì)胞是WT型的其它組相比明顯升高(P0.01)。然而,當(dāng)gp~(91~(phox-/-))中性粒細(xì)胞與WT巨噬細(xì)胞在低氧條件下共培養(yǎng)后,中性粒細(xì)胞7-AAD和Annexin V雙陽性所占的比例與中性粒細(xì)胞是gp~(91~(phox-/-))型的其它組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。將低氧培養(yǎng)條件下巨噬細(xì)胞分泌的外泌體與gp~(91~(phox-/-))中性粒細(xì)胞共培養(yǎng),gp~(91~(phox-/-))中性粒細(xì)胞7-AAD和Annexin V雙陽性所占的比例較Hypoxia+Exos組明顯下降(P0.01)。且低氧培養(yǎng)條件下巨噬細(xì)胞分泌的外泌體不能上調(diào)gp~(91~(phox-/-))中性粒細(xì)胞內(nèi)ROS水平(與Hypoxia+Exos組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01)。9.NADPH氧化酶在失血性休克過程中性粒細(xì)胞壞死中具有重要作用。野生型小鼠(Wild Type,WT)失血性休克后肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞7-AAD和Annexin V雙陽性所占的比例較gp~(91~(phox-/-))小鼠明顯升高(P0.01)。WT小鼠失血性休克后肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞內(nèi)RIPK1與RIPK3 Pearson共定位系數(shù)較gp~(91~(phox-/-))小鼠明顯升高(P0.01)。結(jié)論失血性休克過程中肺泡巨噬細(xì)胞促進(jìn)中性粒細(xì)胞壞死,且巨噬細(xì)胞外泌體介導(dǎo)了這一過程。在體外低氧/復(fù)氧過程中ROS介導(dǎo)了巨噬細(xì)胞外泌體對(duì)中性粒細(xì)胞壞死的促進(jìn)作用。NADPH氧化酶在失血性休克過程中性粒細(xì)胞壞死中具有重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R605.971

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1 鄭振群;;關(guān)于巨噬細(xì)胞的幾個(gè)問題[J];山西醫(yī)藥雜志;1974年12期

2 ;豚鼠巨噬細(xì)胞經(jīng)P_(204)處理后的抗石英細(xì)胞毒作用[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)參考資料(衛(wèi)生學(xué)分冊(cè));1976年04期

3 鄧俠進(jìn);;巨噬細(xì)胞的抗癌作用[J];遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1979年02期

4 陸天才;;疾病對(duì)肺巨噬細(xì)胞的影響[J];煤礦醫(yī)學(xué);1982年01期

5 郭瑞清;祝彼得;;一種分離巨噬細(xì)胞的簡(jiǎn)單方法[J];濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1990年02期

6 謝志堅(jiān);巨噬細(xì)胞異質(zhì)性[J];醫(yī)學(xué)綜述;2001年06期

7 饒艷;運(yùn)動(dòng)及神經(jīng)內(nèi)分泌對(duì)巨噬細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)[J];體育與科學(xué);2002年05期

8 朱金元;;吸煙對(duì)肺巨噬細(xì)胞的影響[J];浙江醫(yī)學(xué)教育;2003年01期

9 張俊峰;過氧化物酶體增殖物激活受體與單核/巨噬細(xì)胞系[J];醫(yī)學(xué)綜述;2004年03期

10 韋錦學(xué);顧軍;;巨噬細(xì)胞的激活誘導(dǎo)死亡[J];生命科學(xué);2006年02期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 史玉玲;王又明;豐美福;;巨噬細(xì)胞激活作用的研究[A];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)第五次會(huì)議論文摘要匯編[C];1992年

2 吳國(guó)明;周輝;;巨噬細(xì)胞和創(chuàng)傷纖維化[A];2009年浙江省骨科學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2009年

3 李奇;王海杰;;透明質(zhì)酸對(duì)于淋巴結(jié)巨噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的影響[A];解剖學(xué)雜志——中國(guó)解剖學(xué)會(huì)2002年年會(huì)文摘匯編[C];2002年

4 劉革修;歐大明;劉軍花;黃紅林;廖端芳;;丙丁酚在體外能抑制巨噬細(xì)胞脂質(zhì)氧化介導(dǎo)的低密度脂蛋白氧化并調(diào)節(jié)氧化巨噬細(xì)胞的分泌功能[A];面向21世紀(jì)的科技進(jìn)步與社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展（下冊(cè)）[C];1999年

5 葉金善;楊麗霞;郭瑞威;;環(huán)氧化酶-2/前列腺素E_2在血管緊張素Ⅱ刺激巨噬細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子中的作用[A];第十三次全國(guó)心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2011年

6 秦帥;陳希;孔德明;;構(gòu)建由綠色熒光標(biāo)記巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系[A];貴州省中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)分泌代謝學(xué)術(shù)會(huì)論文匯編[C];2012年

7 武劍華;徐惠綿;;腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在胃癌中的相關(guān)研究[A];第9屆全國(guó)胃癌學(xué)術(shù)會(huì)議暨第二屆陽光長(zhǎng)城腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2014年

8 何軍;;血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體升高巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第11次心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

9 宋盛;周非凡;邢達(dá);;PDT誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞NO合成的影響[A];第七屆全國(guó)光生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2010年

10 張磊;朱建華;黃元偉;姚航平;;血管緊張素Ⅱ?qū)奘杉?xì)胞(THP-1重細(xì)胞)凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體表達(dá)的影響[A];浙江省免疫學(xué)會(huì)第五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2004年

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1 通訊員 李靜 記者 胡德榮;惡性腫瘤巨噬細(xì)胞未必皆“惡人”[N];健康報(bào);2014年

2 蘭克;以嘗試用巨噬細(xì)胞治癱瘓[N];科技日?qǐng)?bào);2000年

3 薛佳;免疫系統(tǒng)——人體的“衛(wèi)士”[N];保健時(shí)報(bào);2009年

4 記者 胡德榮;鐵泵蛋白“維穩(wěn)”鐵代謝作用首次闡明[N];健康報(bào);2011年

5 侯嘉 何新鄉(xiāng);硒的神奇功能[N];中國(guó)食品質(zhì)量報(bào);2003年

6 唐穎 倪兵 陳代杰;巨噬細(xì)胞泡沫化抑制劑研究快步進(jìn)行[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

7 劉元江;新發(fā)現(xiàn)解釋腫瘤為何易成“漏網(wǎng)之魚”[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2007年

8 本報(bào)記者 侯嘉 通訊員 何新鄉(xiāng);今天你補(bǔ)硒了嗎[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2003年

9 左志剛;升血小板藥使用注意[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報(bào);2007年

10 記者 許琦敏;“鐵泵”蛋白幫助回收鐵元素[N];文匯報(bào);2011年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 周赤燕;巨噬細(xì)胞MsrA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的干預(yù)研究[D];武漢大學(xué);2013年

2 章桂忠;TIPE2蛋白調(diào)控細(xì)胞增殖和炎癥的機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2015年

3 張瑜;DKK1抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積及其相關(guān)分子機(jī)制[D];山東大學(xué);2015年

4 孟濤;異丙酚對(duì)心臟收縮功能的抑制作用及其對(duì)巨噬細(xì)胞分泌功能調(diào)節(jié)的機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2015年

5 周興;基于酵母微囊構(gòu)建新型口服巨噬細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

6 蔣興偉;Tim-3對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控機(jī)制研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2015年

7 劉伯玉;清道夫受體A介導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬鉤端螺旋體研究[D];上海交通大學(xué);2013年

8 楊紹俊;miRNA-155介導(dǎo)ESAT-6誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制及其在結(jié)核診斷中的作用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

9 翟光耀;單核/巨噬細(xì)胞Ly6C~(low)亞群在心肌梗死后瘢痕形成期的抗炎特性研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

10 韓露;TRB3介導(dǎo)的脂肪組織巨噬細(xì)胞極化與糖尿病冠狀動(dòng)脈病變關(guān)系的研究[D];山東大學(xué);2015年

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1 馬春梅;AP0E~(-/-)小鼠TLR9介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化效應(yīng)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化作用的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

2 張譯丹;鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑調(diào)控巨噬細(xì)胞表型對(duì)實(shí)驗(yàn)性矽肺的作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

3 盧文冉;HCV core蛋白作用的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)肝細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

4 李文建;載脂蛋白E影響巨噬細(xì)胞因子表達(dá)及分型的機(jī)制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

5 曹爽;高糖對(duì)巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

6 寧程程;腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在子宮內(nèi)膜癌雌激素敏感性中的作用及機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

7 高龍;PLD4在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞抑制結(jié)腸癌增殖中的作用研究[D];成都醫(yī)學(xué)院;2015年

8 任虹;感染期子宮頸癌U14細(xì)胞荷瘤小鼠抑制巨噬細(xì)胞CCL5分泌的機(jī)制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

9 李美玲;雙酚A對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞極化影響的體外研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

10 劉瓊;黃芪多糖影響巨噬細(xì)胞向脂肪細(xì)胞趨化的作用及機(jī)制研究[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2015年

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本文編號(hào)：2339768