【摘要】：背景:大量研究證實無菌性炎性反應在創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)后繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮著至關重要的作用,但其具體信號轉導與調控機制目前尚不明確。我們前期臨床及基礎研究發(fā)現TBI后腦內核因子-κB (nuclear factor kappa B,NF-κB)炎性反應通路可被顯著激活至某一高峰,然后逐漸下降。提示腦內可能存在某種重要介質或通路在TBI后被激活,從而負向調控炎性反應。因此,尋找此種可以下調TBI后腦內炎性反應的因子或因素顯得愈發(fā)重要。國際最新研究表明CD24可以通過下調NF-κB的活性,從而負向調控無菌性炎性反應。TBI后腦內的炎性反應便是一種無菌性炎性反應,但關于CD24在TBI后腦內無菌性炎性反應中的作用機制至今未有報道。因此,本課題將針對TBI后腦內CD24的表達時程及其在無菌性炎性反應中的潛在作用機制進行研究。方法:本課題首先從臨床研究出發(fā),選取并收集臨床TBI患者術中傷灶周圍腦組織標本作為TBI組,同時收集顱底良性腫瘤手術入路上腦組織作為對照組,運用實時定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)、Western blotting、免疫組織化學染色及免疫熒光技術檢測CD24及炎性反應通路上關鍵因子髓樣分化蛋白88 (myeloid differentiation factor 88, MyD88)的表達及分布情況;使用實時定量PCR對NF-κB下游炎性因子腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)及白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)的mRNA表達水平進行檢測;同時對臨床患者預后進行統(tǒng)計分析。隨后使用C57BL/6小鼠,運用改良Feeney法建立體內TBI模型,分別采用實時定量PCR、Western blotting及免疫熒光雙染方法檢測CD24的表達及細胞定位情況。根據動物實驗結果,采用重組高遷移率族蛋白 1 (recombinant high mobility group box 1,rHMGB1)處理的小鼠原代培養(yǎng)皮層神經元及星形膠質細胞建立體外神經細胞炎性反應模型,分別采用實時定量PCR、Western blotting及免疫熒光方法檢測CD24的表達及分布情況。根據體內、體外實驗中CD24的表達情況,分別運用RNA干擾技術針對CD24進行下調,系統(tǒng)評價NF-κB炎性反應通路的活性變化。采用實時定量PCR及Western blotting技術檢測CD24的mRNA及蛋白表達水平變化;電泳遷移率實驗(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)檢測NF-κB的DNA結合活性;實時定量PCR檢測炎性因子TNF-α及IL-1β的mRNA表達水平,從而探討CD24在TBI后腦內無菌性炎性反應中的具體作用。結果:臨床實驗結果表明:TBI后腦內CD24的mRNA及蛋白表達水平均較對照組明顯升高,且具有時間依賴性,隨致傷時間延長而不斷增高(至72h后);同時CD24的表達可見于神經元、星形膠質細胞及小膠質細胞中。動物實驗中,小鼠TBI后傷灶周圍皮層內CD24的mRNA及蛋白水平均較假手術組明顯增高,且表達高峰位于傷后7d。針對CD24予以RNA干擾后,CD24的表達水平得到顯著抑制,同時NF-1κB活性及其下游炎性因子TNF-α和IL-1β的mRNA水平明顯上調。體外實驗中,小鼠原代皮層神經元及星形膠質細胞中施加rHMGB1后,可以顯著誘導NF-κB炎性反應通路的激活,同時CD24的mRNA及蛋白水平也明顯升高,并且其激活高峰位于rHMGB1施加后36h;針對CD24進行RNA干擾后,神經元及星形膠質細胞中的CD24表達水平可以顯著抑制,同時能夠明顯上調NF-κB炎性反應通路的活性。結論:我們首先從臨床研究發(fā)現TBI后腦內CD24表達水平明顯增高,然后分別從體內、體外實驗兩方面驗證此發(fā)現,并且運用RNA干擾技術發(fā)現CD24的針對性下調可以顯著上調NF-κB炎性反應通路的活性。結果表明TBI后腦內CD24的高表達可能在無菌性炎性反應中發(fā)揮著至關重要的負向調控作用,高度提示CD24的靶向干預可能在TBI的臨床治療中具有潛在的應用價值。
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【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R651.15

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本文編號：2323092