【摘要】：燒傷是以皮膚損傷為始發(fā)因素的創(chuàng)傷,損傷主要是皮膚和黏膜,嚴(yán)重者可傷及皮下及黏膜下組織,如骨及關(guān)節(jié)、肌肉等,甚至內(nèi)臟器官等。及時(shí)封閉、修復(fù)創(chuàng)面是防治創(chuàng)面感染、減輕組織器官功能損傷、防治瘢痕增生、提高重度燒傷患者救治成功率及生活質(zhì)量的基礎(chǔ)。燒傷的根本問題就是創(chuàng)面修復(fù),如何盡早封閉和修復(fù)創(chuàng)面是燒傷治療中的根本。表皮干細(xì)胞(epidermal stem cells,ESCs)是皮膚組織之中特異性干細(xì)胞,是皮膚創(chuàng)面愈合最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)之一,也是皮膚及其皮膚附屬器管生長(zhǎng)發(fā)育、修復(fù)以及改建的源泉。應(yīng)用表皮干細(xì)胞無(wú)限增殖能力及多向分化的潛能等,促使創(chuàng)面修復(fù)由功能修復(fù)到解剖修復(fù)成為了可能。因此表皮干細(xì)胞對(duì)表皮組織及其附屬器官的重建具有重大價(jià)值。淺度以及深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面的修復(fù)主要依賴于殘存和健在的表皮干細(xì)胞脫粘附、增殖、分化以及遷移并最終修復(fù)創(chuàng)面,是創(chuàng)面愈合的主要過程,尤其是毛囊外鞘隆突部的毛囊干細(xì)胞起著重要的作用;同時(shí)表皮干細(xì)胞的脫粘附、增殖、分化、遷移等生物學(xué)行為受到體內(nèi)多種因素的影響。表皮干細(xì)胞離開其特定的干細(xì)胞巢穴遷移,才具有增殖、分化能力,因而表皮干細(xì)胞離巢遷移是啟動(dòng)燒傷創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵步驟。但目前關(guān)于誘使表皮干細(xì)胞脫粘附、離巢遷移、增殖、分化的因素及其機(jī)制并不清楚。一氧化氮(Nitric Oxide,NO)是眾多的小分子生物活性介質(zhì)中的一種,參與了多種生理、病理等過程。NO在創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)、肉芽生長(zhǎng)及創(chuàng)面修復(fù)中均起著重要的作用,具有參與炎癥反應(yīng)、擴(kuò)張血管、收縮創(chuàng)面、抗感染以及促進(jìn)創(chuàng)面膠原合成、成纖維細(xì)胞增殖、增強(qiáng)創(chuàng)面抗張強(qiáng)度、血管生成等。燒傷后早期創(chuàng)面即有大量NO產(chǎn)生,在時(shí)間上與燒傷后表皮干細(xì)胞離巢遷移修復(fù)創(chuàng)面現(xiàn)象相重疊。NO對(duì)創(chuàng)面愈合有多種作用機(jī)制與途徑,但NO促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的具體作用機(jī)制尚未完全清楚,還有待進(jìn)一步的深入研究。燒傷后創(chuàng)面產(chǎn)生大量NO產(chǎn)生,初期主要由角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生,隨后主要由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。創(chuàng)面局部產(chǎn)生的NO在燒傷后第三天左右達(dá)到高峰,并且?guī)缀醢殡S整個(gè)創(chuàng)面愈合的過程。文獻(xiàn)報(bào)道,在氣道上皮細(xì)胞的體外劃痕實(shí)驗(yàn)中NO顯著促進(jìn)細(xì)胞的遷移;NO可通過GC-c GMP途徑使細(xì)胞骨架重排,從而促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞的遷移與創(chuàng)面修復(fù);NO可通過影響Rho GTP酶調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架及細(xì)胞的粘附與遷移。因此我們推測(cè),一氧化氮的促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)作用中是通過影響角質(zhì)細(xì)胞及表皮干細(xì)胞的脫粘附、增殖、分化、遷移等生物學(xué)作用實(shí)現(xiàn)的。no在燒傷后表皮干細(xì)胞脫粘附、離巢、遷移、分化等生物學(xué)變化中的作用及其機(jī)制未見文獻(xiàn)報(bào)道。我們前期研究中,以硝普鈉(snp)為no供體,以角質(zhì)細(xì)胞株hacat細(xì)胞為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)適宜濃度的no具有促進(jìn)hacat細(xì)胞遷移作用,其作用的可能機(jī)制是:1、no通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cgmp的濃度升高,促進(jìn)rhogtpase活化作用增強(qiáng),以及蛋白表達(dá)水平增高,進(jìn)而影響細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)f-actin蛋白聚合,最終促進(jìn)細(xì)胞遷移;2、no通過下調(diào)β1整合素的表達(dá),減少細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的粘附力,進(jìn)而減少細(xì)胞遷移阻力。同時(shí)我們以原代培養(yǎng)人表皮干細(xì)胞為研究對(duì)象,選擇以snap(s-nitroso-n-acetyl-dl-penicillamine)為no供體,深入研究no對(duì)體外原代培養(yǎng)人esc脫粘附離巢、增殖分化及遷移功能的影響;并在體實(shí)驗(yàn)中通過brdu滯留標(biāo)記表皮干細(xì)胞,淺二度燙傷模型研究外源性no對(duì)成年小鼠表皮干細(xì)胞離巢、遷移的作用。本課題在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,我們進(jìn)而探討了燒傷患者創(chuàng)面中no濃度及創(chuàng)面中inos的表達(dá),深入研究no促進(jìn)表皮干細(xì)胞遷移的物質(zhì)基礎(chǔ)和可能機(jī)制,明確no促進(jìn)燒傷等創(chuàng)面愈合的機(jī)理,為進(jìn)一步完善一氧化氮在促進(jìn)創(chuàng)面愈合中的基礎(chǔ)理論和可能的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。本課題重點(diǎn)探討了no通過cgmp\pkg\rhogtpase途徑調(diào)節(jié)表皮干細(xì)胞骨架的重排,進(jìn)而促進(jìn)escs遷移;以及在體no通過增強(qiáng)表皮干細(xì)胞遷移而促進(jìn)創(chuàng)面再上皮化,最終修復(fù)創(chuàng)面。我們將本研究獲得的主要結(jié)果和結(jié)論歸納如下:一、燒傷后創(chuàng)面no的產(chǎn)生:為進(jìn)一步了解燒傷患者創(chuàng)面中no濃度及燒傷不同時(shí)間點(diǎn)no濃度的變化,共收集臨床20例燒傷患者標(biāo)本,其中水泡液46份,血清27份;深二度燒傷創(chuàng)面組織14份,同體正常皮膚組織14份。均符合入選標(biāo)準(zhǔn):年齡18-55,性別不限,燒傷面積≤40%tbsa。收集水泡液、血清及組織塊-80度保存。該項(xiàng)研究?jī)?nèi)容均告知患者,并征得患者和患者家屬的同意,研究對(duì)象簽署知情同意書表示愿意參加該項(xiàng)試驗(yàn)。1、水泡液及血清中no濃度檢測(cè):采用griessreagent法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),小面積(燒傷面積≤40%tbsa)患者血漿中no的濃度相對(duì)恒定在6.44±0.71μm;而燒傷患者水泡液中no隨傷后不同時(shí)間而有較大變化,傷后10小時(shí)內(nèi)的水泡液no濃度為7.73±0.62μm,傷后10至20小時(shí)水泡液no濃度為9.45±0.65μm,傷后20至30小時(shí)水泡液no濃度為7.23±1.53μm,傷后30小時(shí)以上時(shí)水泡液no濃度為6.84±1.08μm,發(fā)現(xiàn)在傷后10至20小時(shí)時(shí)水泡液no濃度最高。2、燒傷創(chuàng)面中no濃度的測(cè)定:組織塊碾磨后用同體積去離子水混合離心取上清。檢測(cè)no濃度方法:采用與griessreagent同體積混合,酶標(biāo)儀測(cè)量od450值,通過標(biāo)準(zhǔn)亞硝酸鹽濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線得出no濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn):正常組織中no濃度為0.32±0.13μm,淺二度創(chuàng)面組織中no濃度為4.70±0.70μm。表明燒傷后創(chuàng)面組織中no濃度較正常組織中no濃度高出約15倍。3、深二度燒傷創(chuàng)面組織中inos的表達(dá):燒傷患者正常組織及淺二度組織經(jīng)石蠟包埋、切片后行免疫熒光組織化學(xué)發(fā)現(xiàn),正常組織中inos表達(dá)不明顯,而創(chuàng)面組織中在表皮的基底層及真皮組織中inos明顯,其中表皮基底層inos的表達(dá)與表皮干細(xì)胞表面標(biāo)志物角質(zhì)蛋白ck19存在共定位。表明,燒傷后表皮干細(xì)胞中高表達(dá)inos。4、深二度燒傷創(chuàng)面組織及正常組織中inos蛋白的表達(dá):燒傷患者正常組織及淺二度組織經(jīng)組織蛋白性蛋白印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn),創(chuàng)面組織中no濃度較正常組織中no濃度高出14.8倍,表明燒傷后表皮組織高表達(dá)inos。二、原代人表皮干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定:主要是進(jìn)行表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及細(xì)胞免疫化學(xué)、克隆實(shí)驗(yàn)和流式等鑒定手段,我們發(fā)現(xiàn):Ⅳ型膠原10min快速黏附法可以快捷、方便的實(shí)現(xiàn)表皮干細(xì)胞分離富集,能較好的維持表皮干細(xì)胞的干性。1、原代人表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng):采用Ⅳ型膠原快速粘附法結(jié)合無(wú)血清角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基分離培養(yǎng)的細(xì)胞符合表皮干細(xì)胞的形態(tài)及"鋪路石"樣克隆生長(zhǎng);采用tripleselect細(xì)胞消化液消化細(xì)胞能快速消化細(xì)胞且能較好保持細(xì)胞的活性。2、細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞中integrinβ1和ck19的表達(dá):所培養(yǎng)的第二代細(xì)胞中表皮干細(xì)胞標(biāo)志物keratin19和integrinβ1均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離培養(yǎng)細(xì)胞α6-integrin及cd71的表達(dá):采用流式細(xì)胞分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)第二代培養(yǎng)細(xì)胞中α6bricd71dim原代培養(yǎng)表皮細(xì)胞率為94.3±4.36%。4、細(xì)胞克隆形成能力檢測(cè):所培養(yǎng)第二代細(xì)胞具有較強(qiáng)的克隆形成能力,克隆形成率為33.1±4.8%。三、no對(duì)表皮干細(xì)胞遷移的影響及機(jī)制研究:(一)no對(duì)培養(yǎng)表皮干細(xì)胞遷移的影響:我們首先進(jìn)行了no供體snap不同作用時(shí)間產(chǎn)生no濃度和snap對(duì)表皮干細(xì)胞的毒性檢測(cè);通過劃痕實(shí)驗(yàn)和活性工作站完成no對(duì)表皮干細(xì)胞遷移和運(yùn)動(dòng)速度的檢測(cè),以及通過細(xì)胞骨架實(shí)驗(yàn)和pulldown技術(shù)檢測(cè)no促進(jìn)表皮干細(xì)胞遷移可能的物質(zhì)基礎(chǔ)。1、no供體snap產(chǎn)生no濃度的檢測(cè):我們通過傳統(tǒng)no檢測(cè)方法griess法測(cè)定snap加入細(xì)胞培養(yǎng)基后產(chǎn)生no情況,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)100μmsnap時(shí)在0、2、6、12、18、24、30、36、48小時(shí)時(shí)生成no的濃度分別為0.173、0.655、1.713、3.553、5.124、6.2818455、6.557、6.878、7.324μm;500μmsnap時(shí)在0、2、6、12、18、24、30、36、48小時(shí)時(shí)生成no的濃度分別為0.209、1.206、2.938、6.349、8.576、11.284、12.448、13.601、14.532μm。表明0-500μmsnap在細(xì)胞培養(yǎng)基中生成no濃度與snap濃度成正相關(guān)、與持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān)。2、snap對(duì)表皮干細(xì)胞安全有效作用濃度測(cè)定:采用cck-8檢測(cè)相對(duì)活細(xì)胞數(shù)量,結(jié)果snap濃度在0-500μm內(nèi)通過cck-8測(cè)量的escs細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異(p0.05),而snap濃度在1000-4000μm時(shí)活細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組顯著減少,snap1000μm時(shí)活細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組比較細(xì)胞存活率為52.12±5.96%;snap2000μm時(shí)活細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組比較細(xì)胞存活率為6.79±1.16%;snap4000μm時(shí)活細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組比較細(xì)胞存活率為5.62±1.63%。表明no供體snap的有效安全作用濃度為0-500μm。3、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)no對(duì)escs遷移功能的影響:結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著snap濃度的升高(0~100μmol/l),劃痕后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞遷移率較對(duì)照組均增加;其中劃痕后12、24h,10、100μmol/lsnap組的遷移率較對(duì)照組有顯著差異(p值均小于0.01);而300、500μmol/lsnap組的遷移率較對(duì)照組減少,其中在劃痕后18、24小時(shí)時(shí)有顯著差異(p值均小于0.05)。其中劃痕12小時(shí)時(shí)與對(duì)照組遷移率(48.8±2.7%)相比,100μmol/lsnap組遷移率達(dá)到了82.1±15.8%(p0.01),而500μmol/lsnap抑制的細(xì)胞遷移率為8.2±7.2%。實(shí)驗(yàn)表明低濃度的no供體snap(0-100μmol/l)時(shí)對(duì)細(xì)胞具有促進(jìn)遷移的作用。4、活細(xì)胞工作站檢測(cè)no對(duì)escs運(yùn)動(dòng)速度的影響:為進(jìn)一步檢測(cè)no對(duì)表皮干細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能的影響,我們通過活性工作站從細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度方面測(cè)定no對(duì)表皮干細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度的影響。研究發(fā)現(xiàn),snap濃度在0~100μmol/l時(shí)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度逐步提高,100μmol/lsnap組的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度為1.07±0.18μm/min,與其他組比較細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度最快。表明,低濃度的no供體snap(0-100μmol/l)時(shí)對(duì)細(xì)胞具有促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的作用,而當(dāng)snap高濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的抑制作用顯著。5、激光共聚焦檢測(cè)no對(duì)escs細(xì)胞骨架蛋白f-actin聚合作用:細(xì)胞骨架是細(xì)胞遷移與運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ),其中細(xì)胞骨架蛋白中最重要的是f-actin蛋白,f-actin蛋白的重組與細(xì)胞遷移具有直接關(guān)系。我們通過鬼筆環(huán)肽染色、激光共聚焦研究發(fā)現(xiàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn):100μmno供體snap組huescs應(yīng)力纖維f-actin纖毛明顯增多,胞內(nèi)應(yīng)力性纖維束增粗,而陰性對(duì)照組纖毛稀少,胞內(nèi)應(yīng)力性纖維束纖細(xì);經(jīng)細(xì)胞骨架f-actin熒光染色強(qiáng)弱分析得出實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組應(yīng)力性纖維增加了31.7%,具有顯著性差異p=0.001。實(shí)驗(yàn)表明,no促進(jìn)huescs應(yīng)力纖維f-actin的聚合。6、pull-down技術(shù)檢測(cè)no活化rhogtpase的作用:rhogtp酶是真核細(xì)胞中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,通過肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行調(diào)控進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng),對(duì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)起著主要作用。為此,我們通過pulldown技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),rhoa活化作用中snap組是對(duì)照組的4.14±0.33倍;rac1活化作用中snap組是對(duì)照組的1.78±0.07倍;cdc42活化作用中snap組是對(duì)照組的1.22±0.17倍。實(shí)驗(yàn)表明,100μmno供體snap組對(duì)rhoa、rac1具有顯著的活化作用,而對(duì)cdc42的活化作用不明顯。(二)no對(duì)培養(yǎng)表皮干細(xì)胞遷移的機(jī)制研究:cgmp-pkg是no最重要的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,為此我們通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞骨架實(shí)驗(yàn)、pull-down實(shí)驗(yàn),分別分組給予cgmp抑制劑odq、pkg抑制劑rp-8pcpt-cgmps、rhoa抑制劑rhosin、cdc42抑制劑zcl278、rac1抑制劑z62954982及snap處理,此外還采用rhoa、rac1、cdc42的特異性小干擾rna驗(yàn)證“no通過cgmp-pkg調(diào)節(jié)活化rhogtpase,進(jìn)而影響細(xì)胞骨架蛋白f-actin的聚合,最終促進(jìn)escs遷移”的假說。1、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)cgmp\pkg\rhogtpase信號(hào)通路在no促進(jìn)escs遷移中的作用:結(jié)果發(fā)現(xiàn),對(duì)照組的細(xì)胞遷移率為74.25±5.59%;snap組的細(xì)胞遷移率為94.06±5.59%;odq+snap組的細(xì)胞遷移率為75.17±7.02%;rp-8pcpt-cgmps+snap組的細(xì)胞遷移率為70.91±10.09%;rhosin+snap組的細(xì)胞遷移率為71.39±9.74%;z62954982+snap組的細(xì)胞遷移率為76.28±7.26%;zcl278+snap組的細(xì)胞遷移率為86.58±4.89%;snap和cgmp、pkg的激動(dòng)劑顯著促進(jìn)escs細(xì)胞的遷移,遷移率與對(duì)照組相比分別增加了9.78%和11.12%。結(jié)果表明,snap對(duì)escs細(xì)胞的遷移作用可被cgmp、pkg、rhoa、rac1抑制劑阻斷,其中rhoa抑制劑的抑制作用最顯著,而cdc42抑制劑的阻斷作用不明顯。2、活細(xì)胞工作站實(shí)驗(yàn)檢測(cè)cgmp\pkg\rhogtpase信號(hào)通路在no促進(jìn)escs運(yùn)動(dòng)速度的作用:結(jié)果發(fā)現(xiàn),對(duì)照組的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度為0.72±0.08μm/min;snap組的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度為0.93±0.14μm/min;odq+snap組的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度為0.78±0.06μm/min;rp-8pcpt-cgmps+snap組的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度為0.74±0.07μm/min;rhosin+snap組的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度為0.73±0.07μm/min;z62954982+snap組的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度為0.72±0.06μm/min;zcl278+snap組的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度為0.73±0.07μm/min。表明:no供體snap促進(jìn)escs細(xì)胞的運(yùn)動(dòng),其作用可被cgmp、pkg、rhoa、rac1抑制劑阻斷,其中rhoa抑制劑的抑制作用顯著,而cdc42抑制劑阻斷snap對(duì)escs運(yùn)動(dòng)速度的影響弱。3、激光共聚焦檢測(cè)cgmp\pkg\rhogtpase信號(hào)通路在no對(duì)escs細(xì)胞骨架蛋白f-actin聚合中的作用:我們采用imagej分析了皮層肌動(dòng)蛋白(corticalactin)和絲狀偽足(filopodia)觀察細(xì)胞骨架蛋白f-actin的聚合情況。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)皮層肌動(dòng)蛋白對(duì)照組為103.33±3.41%,snap組為190.26±2.92%,odq+snap組為87.41±3.20%,rp-8pcpt-cgmps+snap組為104.33±1.75%,rhosin+snap組為80.12±2.21%;z62954982+snap組為120.83±3.61%,zcl278+snap組為141.68±4.75%。細(xì)胞的絲狀偽足百分率對(duì)照組為25.00±3.86%,snap組為41.82±7.60%,odq+snap組為19.66±3.87%,rp-8pcpt-cgmps+snap組為25.27±7.57%,rhosin+snap組為24.00±6.29%,z62954982+snap組為31.87±3.49%,zcl278+snap組為31.14±11.69%。結(jié)果表明:得出no供體snap對(duì)esc細(xì)胞骨架蛋白f-actin具有聚合作用;cgmp\pkg以及rhogtpase的rhoa,rac1抑制劑均可阻斷snap對(duì)escf-actin的聚合作用,而cdc42抑制劑的阻斷作用不顯著。4、pull-down技術(shù)檢測(cè)cgmp\pkg在no活化rhogtpase中的作用:采用pull-down技術(shù)檢測(cè)no供體snap處理表皮干細(xì)胞24小時(shí)對(duì)rhoa,cdc42和racl的活化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),對(duì)rhoa活化作用以對(duì)照組設(shè)為1,snap組為4.46±0.14;odq+snap組為0.89±0.11;rp-8pcpt-cgmps+snap組為1.52±0.12;對(duì)racl活化作用snap組為2.08±0.08,odq+snap組為0.72±0.12,rp-8pcpt-cgmps+snap組為1.22±0.17;對(duì)cdc42活化作用snap組為1.16±0.24,odq+snap組為1.21±0.13;rp-8pcpt-cgmps+snap組為0.89±0.13。表明no通過cgmp、pkg調(diào)節(jié)rhoa,rac1的活化作用。5、pull-down技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間snap對(duì)活化rhoa的作用:采用pulldown技術(shù)檢測(cè)snap在處理后6、12、18、24小時(shí)對(duì)rhoa,cdc42和racl的活化作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),灰度值比較中對(duì)照組活化蛋白比總蛋白設(shè)為1(0小時(shí)),6、12、18、24小時(shí)snap組對(duì)rhoa活化作用分別為3.38±0.56、4.09±0.46、3.60±0.39、4.17±0.43倍;而snap組對(duì)racl活化作用分別為2.55±0.48、2.69±0.75、2.56±0.47、2.69±0.44。表明在給予snap處理后escs中活化的rhogtpase持續(xù)高表達(dá)。6、sirna轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)人表皮干細(xì)胞及sirna干擾效率檢測(cè):50nm的sirna采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染表皮干細(xì)胞,以與rhogtpase無(wú)同源性的葡萄糖氧化酶glo的sirna作為陰性對(duì)照,為避免脫靶效應(yīng)每一個(gè)mrna均采用兩個(gè)不同的sirna。采用wb檢測(cè)sirna的干擾效率均大于75%。同時(shí)我們采用rhoa、rac1和cdc42的特異性sirna干擾實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了no通過rhogtpase的rhoa和rac1在no促進(jìn)表皮干細(xì)胞遷移中的作用。7、sirna干擾后檢測(cè)rhogtpase在no促進(jìn)escs遷移中的作用:采用rhogtpase的特異性sirna干擾目的基因的表達(dá)后進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),snap組的細(xì)胞遷移率為92.89±3.99%;siglo+snap組的細(xì)胞遷移率為90.68±4.22%;rhoasirna+snap組的細(xì)胞遷移率為53.25±5.78%、51.42±5.23%;rac1sirna+snap組的細(xì)胞遷移率為55.23±9.92%、61.06±8.43%;cdc42sirna+snap組的細(xì)胞遷移率為81.62±10.75%、80.29±13.04%。表明rhoasirna、rac1sirna可阻斷snap對(duì)esc的遷移作用。表明,no通過rhogtpase的rhoa和rac1影響表皮干細(xì)胞的遷移作用。8、sirna干擾后檢測(cè)rhogtpase在no促進(jìn)escs運(yùn)動(dòng)中的作用:采用rhogtpase的特異性sirna干擾目的基因的表達(dá)后進(jìn)行活性工作檢測(cè)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速度實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),siglo+snap組的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度為0.96±0.07μm/min;rhoasirna+snap組的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度為0.74±0.06μm/min、0.76±0.07μm/min;rac1sirna+snap組的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度為0.83±0.05μm/min、0.83±0.03μm/min;cdc42sirna+snap組的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度為0.90±0.10μm/min、0.93±0.09μm/min。表明rhoasirna、rac1sirna可阻斷no對(duì)esc運(yùn)動(dòng)速度的促進(jìn)作用。9、sirna干擾后檢測(cè)rhogtpase在no促進(jìn)骨架蛋白f-actin聚合中的作用:采用rhogtpase的特異性sirna干擾目的基因的表達(dá)后給予no供體snap處理24小時(shí)。通過imagej分析了皮層肌動(dòng)蛋白(corticalactin)和絲狀偽足(filopodia)的表達(dá)觀察細(xì)胞骨架蛋白f-actin的聚合與重排作用。研究表明,rhogtpase的rhoa、rac1的mrna干擾小rna可阻斷snap對(duì)escs的f-actin的聚合作用。四、no對(duì)皮膚創(chuàng)面愈合及在體表皮干細(xì)胞遷移的影響:為進(jìn)一步探討no在創(chuàng)面愈合、上皮化以及進(jìn)一步驗(yàn)證no對(duì)esc的在體遷移情況,我們?cè)赽rdu在體標(biāo)記表皮干細(xì)胞基礎(chǔ)上采用全層皮膚缺損模型研究no在創(chuàng)面愈合、上皮化以及對(duì)esc遷移。應(yīng)用brdu在體標(biāo)記表皮干細(xì)胞后孔器器打孔,傷口大小為直徑4.5mm,分組分別給予腹腔注射生理鹽水組,甘氨酸(gly),一氧化氮合成底物(l-精氨酸)及一氧化氮合酶抑制劑(l-nmma)。分別于傷后0、1、3、5、7、9天觀察創(chuàng)面愈合情況,于第9天取材做he染色觀察創(chuàng)面上皮化情況,于第12天觀察esc遷移情況。1、no在創(chuàng)面愈合中的作用:我們采用全層皮膚缺損模型模型檢測(cè)no對(duì)創(chuàng)面的愈合作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),致創(chuàng)后第1、3、5、7、9天創(chuàng)面愈合率分析生理鹽水組分別為20.08±3.03%,47.97±4.99%,70.00±3.49%,80.54±2.17%,70.95±3.56%;L-精氨酸組致分別為29.30±3.55%,47.97±4.99%,89.61±2.69%,94.74±2.43%,98.75±0.81%;L-NMMA組為18.91±3.06%,44.47±4.99%,64.58±4.52%,72.45±2.52%,76.72±3.84%。結(jié)果表明,創(chuàng)面缺損模型中NO合成底物L(fēng)-精氨酸促進(jìn)創(chuàng)面愈合;NO合成酶抑制劑L-NMMA創(chuàng)面愈合速度較對(duì)照組明顯減慢。2、NO在創(chuàng)面上皮化中的作用:同上我們?cè)谥聞?chuàng)后第9天創(chuàng)面組織取材,切片行HE-染色并經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。發(fā)現(xiàn),生理鹽水組未上皮化創(chuàng)面大小為1.44±0.32mm,未上皮化創(chuàng)面大小甘氨酸組為1.37±0.52mm、L-精氨酸組0.38±0.41mm、L-NMMA為2.54±0.61mm。實(shí)驗(yàn)表明,創(chuàng)面缺損模型中NO合成底物L(fēng)-精氨酸促進(jìn)創(chuàng)面上皮化,具有顯著性差異;NO合成酶抑制劑L-NMMA與對(duì)照組比較明顯抑制創(chuàng)面上皮化。3、BrdU標(biāo)記ESC后全層皮膚缺損模型中NO對(duì)ESC遷移作用研究:Brd U在體標(biāo)記表皮干細(xì)胞基礎(chǔ)上,在全層皮膚缺損模型中給與NO處理,研究NO對(duì)ESC遷移情況。研究發(fā)現(xiàn),在同一高倍視野再生表皮中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)照組為12.27±2.67個(gè),甘氨酸組為14.88±5.14個(gè),L-精氨酸組為24.04±8.34個(gè),L-NMMA組為6.67±2.42個(gè)。表明,L-精氨酸組創(chuàng)面上皮化中的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞較其他組顯著增多,同時(shí)NO合成酶抑制劑L-NMMA組中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞較其他組少。總結(jié):1、燒傷后表皮干細(xì)胞可能通過高表達(dá)i NOS,而促進(jìn)燒傷創(chuàng)面NO的大量產(chǎn)生;2、Ⅳ型膠原快速黏附結(jié)合K-SFM角質(zhì)細(xì)胞專用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)是一種簡(jiǎn)單、快捷、有效分離、純化人表皮干細(xì)胞的方法;3、NO供體SNAP對(duì)體外培養(yǎng)人表皮干細(xì)胞的最佳作用濃度為100μM。4、NO通過cGMP/PKG調(diào)節(jié)Rho GTPase的Rho A和Rac1的活化影響細(xì)胞骨架蛋白F-actin的聚合,進(jìn)而促使表皮干細(xì)胞遷移,最終促進(jìn)創(chuàng)面愈合。5、在體實(shí)驗(yàn)中,NO可能通過促進(jìn)表皮干細(xì)胞遷移,而促進(jìn)創(chuàng)面再上皮化,最終促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合。綜上所述,燒傷后創(chuàng)面表皮干細(xì)胞可能通過高表達(dá)i NOS,產(chǎn)生大量NO,產(chǎn)生的NO通過c GMP/PKG調(diào)節(jié)Rho GTPase中Rho A和Rac1的活化,繼而增加細(xì)胞骨架F-actin蛋白的聚合,進(jìn)而促使表皮干細(xì)胞遷移,最終促進(jìn)創(chuàng)面愈合。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R644

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9 廣e，

本文編號(hào)：2318469