【摘要】：【背景】 盡管對(duì)休克的復(fù)蘇、救治已有三百余年的研究歷史，但面對(duì)重癥失血性休克時(shí)使用傳統(tǒng)治療方法仍然效果不佳、死亡率高。重癥失血性休克的病理生理學(xué)特點(diǎn)是：微循環(huán)持續(xù)低灌流和頑固性低血壓。如何找到新的治療位點(diǎn)以改善這兩個(gè)病理生理改變是治療重癥休克的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)小組前期對(duì)重癥失血性休克大鼠的肝臟中的差異基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)歷了相同條件的重癥失血性休克后，存活與死亡的大鼠肝臟中AOC3基因水平差異明顯。 含銅胺氧化酶3（AOC3）基因編碼的蛋白質(zhì)被稱為血管粘附蛋白-1（VAP-1），VAP-1抗原的克隆揭示其屬于氨基脲敏感性胺氧化酶（SSAO）。VAP-1具有雙重功能，作為粘附分子其能在炎癥下誘導(dǎo)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附，作為胞外酶又可對(duì)伯胺類物質(zhì)進(jìn)行氧化脫胺反應(yīng)。既往研究表明VAP-1在白細(xì)胞滲出、粘附級(jí)聯(lián)反應(yīng)、糖代謝調(diào)節(jié)、血管損傷等方面都具有重要意義。但AOC3基因與失血性休克之間的關(guān)系尚未見報(bào)道。 【目的】 1、明確重癥失血性休克及復(fù)蘇過程中大鼠小腸及血清中AOC3基因及其編碼蛋白VAP-1的表達(dá)和酶活性變化； 2、明確缺氧條件下大鼠腸微血管內(nèi)皮細(xì)胞（RIMEC）中AOC3基因及其編碼蛋白VAP-1的表達(dá)及誘導(dǎo)白細(xì)胞粘附功能的變化； 3、明確抑制VAP-1/SSAO活性對(duì)缺氧條件下RIMEC中VAP-1誘導(dǎo)白細(xì)胞粘附功能的影響； 4、明確抑制VAP-1/SSAO活性對(duì)重癥失血性休克及復(fù)蘇后的大鼠小腸微循環(huán)及粘膜損傷和大鼠24小時(shí)生存率的影響。 【方法】 1、建立重癥失血性休克及復(fù)蘇大鼠模型（股動(dòng)脈2.0ml/kg min勻速放血，維持35-45mmHg休克血壓1小時(shí)，1/2總失血量的血液＋3/2總失血量的乳酸林格氏液復(fù)蘇），采集休克前、休克1小時(shí)后、復(fù)蘇1小時(shí)后的小腸組織及血清； 2、采用realtime RT-PCR測(cè)量小腸組織中的AOC3基因的mRNA值，Western blot測(cè)量小腸組織中的VAP-1含量，免疫組化檢測(cè)小腸組織中VAP-1的表達(dá)，ELISA試劑盒法測(cè)量血清中可溶性VAP-1（sVAP-1）的含量和VAP-1/SSAO活性； 3、制備AOC3過表達(dá)腺病毒并將其轉(zhuǎn)染RIMEC，realtime RT-PCR、Western Blot分別檢測(cè)常氧及缺氧條件（95%N2和5%CO2培養(yǎng)24小時(shí)）下、正常及腺病毒轉(zhuǎn)染后的RIMEC中AOC3基因及VAP-1的水平； 4、使用白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附試劑盒分別檢測(cè)正常及加入SSAO抑制劑（1mg/ml2-溴乙胺）、常氧及缺氧條件下、正常及腺病毒轉(zhuǎn)染后的RIMEC與大鼠白細(xì)胞粘附情況； 5、復(fù)制重癥失血性休克及復(fù)蘇大鼠模型，復(fù)蘇時(shí)加用不同濃度（20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg）的2-溴乙胺或等體積的生理鹽水，比較復(fù)蘇1小時(shí)后各組血清中VAP-1/SSAO活性； 6、復(fù)制重癥失血性休克及復(fù)蘇大鼠模型，復(fù)蘇時(shí)實(shí)驗(yàn)組加用20mg/kg2-溴乙胺，比較實(shí)驗(yàn)組和生理鹽水對(duì)照組中復(fù)蘇1小時(shí)及24小時(shí)后的血壓，活體顯微鏡檢測(cè)復(fù)蘇1小時(shí)后小腸微循環(huán)情況（微血管管徑及毛細(xì)血管流速），檢測(cè)復(fù)蘇24小時(shí)后小腸粘膜損傷情況（Chiu’s評(píng)分）和小腸粘膜上皮細(xì)胞凋亡情況（TUNEL檢測(cè)），比較大鼠24小時(shí)生存率�！窘Y(jié)果】 1、重癥失血性休克時(shí)小腸組織AOC3基因的mRNA值、VAP-1蛋白水平以及血清sVAP-1水平、VAP-1/SSAO活性均較假休克組顯著升高（P值均0.001），復(fù)蘇后上述各值較休克組下降，但仍顯著高于假手術(shù)組，小腸組織免疫組化顯示VAP-1主要表達(dá)于小腸微血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的胞漿中； 2、缺氧條件下RIMEC中AOC3基因的mRNA值較常氧條件下顯著升高（P0.001），且在AOC3基因腺病毒轉(zhuǎn)染后的RIMEC中升高更明顯（P0.001），VAP-1蛋白的變化同AOC3基因變化一致； 3、缺氧條件下RIMEC中VAP-1誘導(dǎo)的白細(xì)胞粘附功能較常氧條件下顯著升高（P=0.026），2-溴乙胺能顯著抑制VAP-1誘導(dǎo)的白細(xì)胞粘附功能，無論是在正常RIMEC中（P=0.001）還是在AOC3基因腺病毒轉(zhuǎn)染后的RIMEC中（P0.001）； 4、相對(duì)于生理鹽水對(duì)照組，使用20mg/kg的2-溴乙胺就能顯著抑制重癥失血性休克及復(fù)蘇后的大鼠血清VAP-1/SSAO活性（P=0.005），并隨著2-溴乙胺濃度上升而抑制程度上升； 5、相對(duì)于生理鹽水對(duì)照組，使用20mg/kg的2-溴乙胺能使重癥失血性休克及復(fù)蘇后的大鼠血壓（復(fù)蘇1小時(shí)和24小時(shí)后）顯著升高（P值分別0.010和0.039），能顯著提高小腸真毛細(xì)血管血流速度（P=0.024），而對(duì)毛細(xì)血管前微動(dòng)脈和毛細(xì)血管后微靜脈的管徑無顯著影響（P值分別為0.184和0.237），對(duì)小腸粘膜損傷的Chiu’s評(píng)分有顯著改善（P=0.022），對(duì)小腸粘膜上皮細(xì)胞的凋亡指數(shù)有顯著改善（P=0.002），能提高休克大鼠24小時(shí)生存率（90%對(duì)60%）�！窘Y(jié)論】 1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)重癥失血性休克能刺激AOC3基因及編碼蛋白VAP-1的表達(dá)、酶活性顯著增高，，而液體復(fù)蘇能減輕這種增高； 2、體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)缺氧條件能刺激AOC3基因及編碼蛋白VAP-1的表達(dá)及誘導(dǎo)白細(xì)胞粘附功能顯著增高，VAP-1/SSAO抑制劑能顯著抑制這種誘導(dǎo)白細(xì)胞粘附功能上的增高； 3、使用VAP-1/SSAO抑制劑能顯著改善重癥失血性休克及復(fù)蘇后的低血壓以及微循環(huán)中的真毛細(xì)血管流速（而不是微血管管徑），能顯著改善小腸粘膜的損傷和細(xì)胞凋亡，提高大鼠24小時(shí)生存率。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R459.7

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本文編號(hào)：2297557