【摘要】：氧氣的供給往往是發(fā)酵過程中影響產(chǎn)物產(chǎn)率的一個限制因素,因此充足的氧供成為發(fā)酵穩(wěn)定、產(chǎn)量提高和降低成本的關鍵。傳統(tǒng)的供氧方法如增加通氣量等存在著高耗能和對設備條件的要求苛刻等問題。20世紀70年代末透明顫菌(Vitreoscilla)中血紅蛋白(Vitreoscilla Hemoglobin, VHb)的發(fā)現(xiàn),促使血紅蛋白基因工程走上舞臺并對抗生素工業(yè)和其他藥物發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展起了巨大推動作用。將透明顫菌血紅蛋白基因(Vitreoscilla Hemoglobin gene, vgb)通過基因工程的手段轉入宿主細胞,構建工程菌,可以大大提高發(fā)酵菌株對氧的利用率,從而提高產(chǎn)量,節(jié)約成本。 納米技術是指利用單個原子、分子制造物質的科學技術,研究結構尺寸在0.1至100nm范圍內材料的性質和應用。納米藥物是指運用納米技術和納米載體制備的一類藥物新制劑。這其中,納米膠束作為一種多功能納米技術在難溶性藥物的遞送研究中獲得了巨大的關注,其載藥能力強、穩(wěn)定性高、制備工藝簡單、載體多樣性、體內可降解、跨膜能力強及對抗腸道上皮p-糖蛋白等特點,被認為是未來提高難溶性藥物口服生物利用度的主要研究方向。 本研究通過對啦基因工程菌的構建、新型納米載體材料的合成、納米膠束的制備及體內外藥學性質的考察等研究,為他克莫司原料和新劑型的開發(fā)研究及未來應用奠定基礎。課題主要研究方法與結果如下。1Vgb基因工程菌的構建及vgb基因對他克莫司產(chǎn)量影響的研究 首先,通過傳統(tǒng)的紫外誘變技術初步提高筑波鏈霉菌(Streptomyces tsukubaensis)發(fā)酵產(chǎn)他克莫司的產(chǎn)量。紫外誘變條件為：孢子濃度為107～108CFU/mL,15W紫外燈管距離20cm照射100s,致死率可達90%以上。在此條件下,以白色念球菌為指示菌進行雙層平板抑菌實驗,并經(jīng)HPLC最終測定他克莫司的量,獲得兩株正突變菌株,他克莫司產(chǎn)量最大提高量為27.7%。其次利用基因工程技術進一步提高他克莫司產(chǎn)量。PCR擴增vgb基因,構建含vgb基因的重組質粒,采用大腸桿菌-鏈霉菌屬間接合轉移的方式將重組質粒整合入鏈霉菌基因組中,獲得重組vgb基因工程菌。經(jīng)CO-差光譜分析法檢測到重組菌株中表達的有活性的VHb,證實重組vgb基因筑波鏈霉菌的成功構建。與原始菌相比,插入vgb基因的重組菌株在控氧條件下發(fā)酵他克莫司產(chǎn)量提高了兩倍。最后,對發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。確定的發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖25g/L,糊精80g/L,甘油10g/L,豆餅粉10g/L,大豆蛋白胨10g/L。通過對種齡與接種量的優(yōu)化,確定了筑波鏈霉菌工程茵在種子培養(yǎng)基中生長20h,以2%的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基為最佳條件。經(jīng)過優(yōu)化后的他克莫司產(chǎn)量最高可達127.78～130.31mg/L。這些結果為提高工業(yè)菌中他克莫司及其他抗生素產(chǎn)量提供了一個有效的策略。 2他克莫司甲氧基聚乙二醇-聚乳酸納米膠束的制備、表征及體外釋放行為研究 以辛酸亞錫為催化劑,由丙交酯和單甲氧基聚乙二醇通過開環(huán)聚合反應合成了不同嵌段比的兩親性二嵌段聚合物甲氧基聚乙二醇-聚乳酸(MPEG-PLA),經(jīng)過篩選,嵌段比為1：1的甲氧基聚乙二醇-聚乳酸(MPEG5000-PLA5000)共聚物裝載他克莫司所形成的納米膠束效果最佳。選擇乳液溶劑去除法制備納米膠束,并采用均勻設計-效應面法優(yōu)化處方及工藝,確定最優(yōu)處方為：4.5%的MPEG-PLA的四氫呋喃溶液作為有機相,他克莫司的投藥量為5mg,油/水比例1：20。優(yōu)化后制得納米膠束呈球形外觀,符合核-殼結構的特征。平均粒徑為90.5nm,分散均勻(PDI=0.100±0.023),載藥量達到9.5%,包封率98.8%。體外釋放結果顯示,他克莫司納米膠束具有明顯的緩釋特性,對體外釋放數(shù)據(jù)進行數(shù)學模型擬合,符合Higuchi方程,其相關系數(shù)最大為0.9992。體外安全性實驗顯示,當MPEG5000-PLA5000載體材料濃度為1000μg/mL時,HEK293細胞存活率達到70%以上,說明該載體材料安全性較好,不會對機體產(chǎn)生毒性。 3他克莫司甲氧基聚乙二醇-聚乳酸納米膠束大鼠體內藥動學及肝移植大鼠體內藥效學研究 以上市他克莫司膠囊為對照,研究了他克莫司納米膠束大鼠體內的藥動學規(guī)律,建立肝移植大鼠模型,并進行了肝移植大鼠藥效學研究。 他克莫司納米膠束大鼠體內的藥動學結果顯示,與口服他克莫司膠囊相比,他克莫司納米膠束給藥后吸收速度更快,Tmax由3h提前至1h,半衰期和平均滯留時間均延長,分別由13.698h和23.593h延長至16.573h和24.044h,生物利用度明顯提升,藥-時曲線下面積由508.251ng/mL-h提高至886.703ng/mL-h。本研究實現(xiàn)了納米膠束增強吸收、提高生物利用度和緩釋的作用。肝移植大鼠體內藥效學研究結果顯示,他克莫司納米膠束組能更好地延長肝移植大鼠的生存期。移植后大鼠給予他克莫司納米膠束后谷丙轉氨酶和總膽紅素水平明顯低于對照組；肝臟病理圖片結果表明,他克莫司納米膠束能夠更好地對抗排斥反應所造成的肝損傷,起到肝臟保護作用。 綜上所述,本研究構建的vgb基因筑波鏈霉菌工程菌能夠顯著改善發(fā)酵過程中因溶氧低造成的他克莫司產(chǎn)量低的問題,為提高他克莫司產(chǎn)量提供了新的思路。所制備的他克莫司納米膠束具有制備工藝簡單、粒徑分布均勻、載藥量高、穩(wěn)定性好、吸收迅速、釋藥緩慢、生物利用度高、生物相容性好等特點,為提高難溶性藥物口服生物利用度提供了一種新思路、新工具和和新手段。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R657.3

【參考文獻】

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本文編號：2278303