【摘要】：創(chuàng)傷性腦損傷是導(dǎo)致人們致殘的一個(gè)主要原因。在顱腦外傷后，腦組織會(huì)經(jīng)歷初級(jí)損傷和二次腦損傷。二次腦損傷在顱腦損傷后發(fā)揮著重要的作用。目前很多研究證實(shí)，脂質(zhì)過氧化介質(zhì)釋放，細(xì)胞凋亡和自由基的產(chǎn)生，都參與了腦外傷后繼發(fā)性腦損害的病理機(jī)制,很多關(guān)鍵分子參與了TBI的機(jī)制。 NKCC1為細(xì)胞膜上的一種水通道蛋白，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要的作用。最近的研究表明NKCC1參與調(diào)節(jié)了腦部疾病中很多細(xì)胞和分子的功能。然而，NKCC1在創(chuàng)傷性腦損傷的作用機(jī)制尚不清楚。Homer1a為即早基因（IEG）的一種，在阿爾茨海默氏癥、帕金森氏病、創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）等疾病中起著至關(guān)重要的作用。此外，最新的研究證實(shí)，Homer1a在創(chuàng)傷性腦損傷中起到神經(jīng)保護(hù)的作用。因此，我的研究的目的是探索NKCC1在創(chuàng)傷性腦損傷中的作用以及它與內(nèi)源性Homer1a之間的相互作用。 實(shí)驗(yàn)一：離體神經(jīng)元機(jī)械性損傷模型的建立 目的：為了模仿離體創(chuàng)傷性腦外傷，我們建立了一個(gè)可靠并且有效的離體小鼠皮層神經(jīng)元機(jī)械性損傷模型。方法：這種模型通過用消毒過的21號(hào)槍頭在培養(yǎng)皿上平行劃傷培養(yǎng)神經(jīng)元，從而達(dá)到模擬體外創(chuàng)傷性腦外傷的效果。通過對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)的改變的觀察，乳酸脫氫酶（LDH）的釋放以及末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）來觀察神經(jīng)元機(jī)械性劃傷后的改變。結(jié)果：離體培養(yǎng)的神經(jīng)元核成圓形或橢圓形，核仁大并且清晰。在顯微鏡下可以清晰的觀察到神經(jīng)元核仁和核膜。神經(jīng)元機(jī)械性劃傷后24h，細(xì)胞上清液中的乳酸脫氫酶（LDH）升高明顯，于此同時(shí)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）結(jié)果顯示，機(jī)械性損傷后神經(jīng)元?jiǎng)潅麅蓚?cè)出現(xiàn)顯著地凋亡。結(jié)論：這種離體神經(jīng)元機(jī)械性損傷模型簡(jiǎn)單并且可靠，可以很好的模擬體外創(chuàng)傷性腦損傷，為研究創(chuàng)傷性腦損傷提供了良好的研究方法。 實(shí)驗(yàn)二：重物下落裝置致體內(nèi)創(chuàng)傷性腦損傷模型的建立 目的：為了進(jìn)一步研究小鼠創(chuàng)傷性腦損傷的病理生理機(jī)制，更好的模擬創(chuàng)傷性腦損傷的發(fā)生和發(fā)展，我們建立了一個(gè)非�？煽坎⑶覍�(shí)用的模型。方法：這種模型是在Mamarou模型的基礎(chǔ)上改進(jìn)的。我們通過腦干濕重方法檢測(cè)創(chuàng)傷性腦損傷后小鼠腦含水量的改變，，HE染色觀察小鼠大腦皮層損傷情況，利用TUNEL法觀察小鼠大腦皮層損傷后凋亡的情況。結(jié)果：損傷后小鼠大腦12h和24h的腦含水量比正常組高，；HE染色發(fā)現(xiàn)在皮層和海馬損傷區(qū)域邊緣，損傷組較正常組小鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，數(shù)量明顯減少，空泡增多，一些細(xì)胞出現(xiàn)核固縮，碎裂TUNEL12h染色結(jié)果顯示，在腦外傷區(qū)域可以發(fā)現(xiàn)大量的TUNEL陽性細(xì)胞。結(jié)論：這種重物下落引起的體內(nèi)小鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型操作簡(jiǎn)單，模型穩(wěn)定性高。 實(shí)驗(yàn)三：NKCC1和Homer1a在創(chuàng)傷性腦損傷后的表達(dá)變化規(guī)律 目的：為了觀察NKCC1和Homer1a在體內(nèi)和體外創(chuàng)傷性腦損傷后的表達(dá)變化規(guī)律。方法：利用聚合酶鏈（PCR）反應(yīng)和采用免疫印跡（WesternBlot）來分別觀察NKCC1和Homer1a的mRNA和蛋白的表達(dá)變化規(guī)律；利用雙重免疫熒光染色觀察二者的在皮層和海馬的共定位情況。結(jié)果：離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NKCC1mRNA和蛋白在機(jī)械性損傷后表達(dá)隨著損傷時(shí)間表達(dá)升高，1h達(dá)到最高點(diǎn)，隨后表達(dá)逐漸下降；Homer1a蛋白在機(jī)械性損傷后隨著損傷時(shí)間表達(dá)升高，6h達(dá)到最高點(diǎn)，隨后表達(dá)逐漸下降；雙重免疫熒光染色結(jié)果顯示，體內(nèi)創(chuàng)傷性腦損傷12h，NKCC1和Homer1a在小鼠皮層和海馬組織中存在著共定位。結(jié)論：創(chuàng)傷性腦損傷后NKCC1和Homer1a都出現(xiàn)顯著增加，免疫熒光染色結(jié)果提示，創(chuàng)傷性腦損傷后NKCC1和Homer1a出現(xiàn)共定位情況，可能提示它們?cè)趧?chuàng)傷性腦損傷后發(fā)揮相互調(diào)控的重要作用。 實(shí)驗(yàn)四：創(chuàng)傷性腦損傷后NKCC1和Homer1a以及ERK的相互作用關(guān)系 目的：為了研究創(chuàng)傷性腦損傷后NKCC1和Homer1a以及ERK的相互調(diào)控作用。方法：利用NKCC1的抑制劑布美他尼以及si-RNA降低NKCC1的活性，利用腦干濕重，蛋白免疫印跡，TUNNEL，LDH方法。結(jié)果：與對(duì)照組相比布美他尼可以顯著抑制離體神經(jīng)元LDH的釋放，TUNEL染色提示布美他尼和NKCC1si-RNA可以顯著降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡。體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，布美他尼可以降低小鼠大腦腦含水量，減輕腦水腫，降低皮層組織神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。體內(nèi)和體外試驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組和空載體相比，抑制NKCC1的活性可以升高Homer1a蛋白的表達(dá)，并降低p-ERK蛋白的表達(dá)。結(jié)論：NKCC1在創(chuàng)傷性腦損傷后發(fā)揮著神經(jīng)損害的作用，NKCC1的抑制劑以及si-RNA可以起到神經(jīng)保護(hù)作用。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R651.15

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2251761