【摘要】：目的：采用螢火蟲熒光素酶(Fluc)和熒光染料CyI (Cy5的衍生物)標記SD大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs),體外研究光學標記干細胞的有效性。將CyI染料標記的BMSCs/Fluc植入不同體重大鼠、小鼠急性心梗模型心肌組織中,探索在不同動物模型中光學示蹤干細胞的可行性。結合超小超順磁性氧化鐵顆粒(USPIO)標記BMSCs/Fluc,雙模態(tài)示蹤干細胞在植入心肌組織后的存活、增殖、遷移和畸胎瘤形成。 方法：將成功轉染、穩(wěn)定表達Fluc的SD大鼠BMSCs/Fluc配制成不同濃度細胞液,行體外生物發(fā)光成像(BLI),驗證Fluc標記有效性。采用不同CyI濃度和孵育時間對BMSCs/Fluc進行孵育。行體外熒光成像,確定恰當孵育條件。使用含USPIO(40μg/ml)和多聚賴氨酸(PLL,1.5μg/ml)的培養(yǎng)基與BMSCs/Fluc共孵育24h,普魯士藍染色觀察鐵顆粒細胞內(nèi)分布。200g、150g、100gSD大鼠、20-25g Bal b/c小鼠各5只,開胸結扎冠脈前降支構建心梗模型,心肌植入CyI標記BMSCs/Fluc,術后第1天行BLI,選擇陽性動物模型(Bal b/c小鼠)行后續(xù)實驗。Bal b/c小鼠心梗模型心肌植入USPIO標記BMSCs/Fluc,術后第1、3、6、9天行生物發(fā)光成像,術后第3天行磁共振檢查。取病理行HE染色和普魯士藍染色觀察心肌組織USPIO顆粒分布情況。 結果：CyI孵育濃度1.0×10-6、孵育時間4h時,熒光強度最強,死細胞數(shù)未見明顯變化。CyI與Fluc光信號強度均隨細胞數(shù)增加而線性增加。在體光學成像中,不同體重大鼠及小鼠心梗模型心臟均未見CyI熒光信號,離體可見。Bal b/c小鼠心梗模型BLI可見光信號,但SD大鼠BLI未見。USPIO標記BMSCs/Fluc植入Bal b/c小鼠心梗模型心肌組織中后,BLI光強度逐漸減少,9天內(nèi)降至0,表明干細胞逐漸死亡,未見增殖、遷移及畸胎瘤形成。磁共振可見左心室前壁低信號區(qū)域。病理結果顯示USPIO與移植干細胞在心肌的分布一致。 結論： 1、CyI孵育濃度1.0×10-6mol/L孵育時間4h可安全有效標記BMSCs/Fluc,且體外檢測熒光強度隨細胞數(shù)量增加而增加,呈線性關系； 2、Fluc可對Bal b/c小鼠心梗模型心肌局部注射干細胞進行在體生物發(fā)光成像,CyI熒光染料標記可在離體條件下示蹤移植干細胞； 3、USPIO標記的BMSCs/Fluc植入Bal b/c小鼠心梗模型心肌組織中后,生物發(fā)光信號逐漸減少,表明干細胞逐漸死亡,未見增殖、遷移及畸胎瘤形成；MRI可對心肌移植的USPIO標記的BMSCs/Fluc進行在體示蹤；病理結果顯示USPIO與移植干細胞在心肌的分布一致
[Abstract]:Aim: to investigate the effectiveness of optical labeling of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) with fluorescent luciferase (Fluc) and fluorescent dye CyI (Cy5 derivative) in vitro. BMSCs/Fluc labeled with CyI dye was implanted into myocardial tissue of rats with different body weight and acute myocardial infarction in mice to explore the feasibility of optical tracing stem cells in different animal models. The survival, proliferation, migration and teratoma formation of ultrasmall superparamagnetic iron oxide (USPIO) labeled BMSCs/Fluc, double mode tracer stem cells after implantation of myocardial tissue. Methods: SD rat BMSCs/Fluc which was successfully transfected and stably expressed Fluc was prepared into different concentrations of cell fluid. In vitro bioluminescence imaging (BLI),) was performed to verify the effectiveness of Fluc labeling. BMSCs/Fluc was incubated with different CyI concentration and incubation time. Fluorescence imaging in vitro was performed to determine the appropriate incubation conditions. The culture medium containing USPIO (40 渭 g/ml) and polylysine (PLL,1.5 渭 g/ml) was incubated with BMSCs/Fluc for 24 h. Prussian blue staining was used to observe the distribution of iron granulosa cells in 5 rats with 20 to 25 g Bal b / c each. The myocardial infarction model was established by ligation of the anterior descending coronary artery. The BLI, selective positive animal model (Bal b / c mice) was performed on the first day after the implantation of CyI labeled BMSCs/Fluc, (Bal b / c mice). The myocardial infarction model of Bal / b / c mice was implanted with USPIO labeled with USPIO for 6 days, then bioluminescent imaging was performed on the first day, and magnetic resonance imaging was performed on the third day after the operation. HE staining and Prussian blue staining were used to observe the distribution of USPIO particles in myocardium. Results the fluorescence intensity was the strongest at the concentration of 1.0 脳 10 ~ (-6) and the incubation time of 4 h. The number of dead cells did not change obviously. The intensity of light signal of both Cyi and Fluc increased linearly with the increase of the number of cells. In vivo optical imaging, there was no CyI fluorescence signal in heart of rats and mice with different body weight, but BLI visible signal was observed in isolated myocardial infarction model of Bal / b / c mice. However, BLI of SD rats did not see. USPIO-labeled BMSCs/Fluc was implanted into myocardial tissue of Bal b / c mice. The light intensity of BLI decreased gradually within 9 days, indicating that stem cells died gradually, no proliferation, migration and teratoma formation. Mr imaging showed the left ventricular anterior wall with low signal intensity. Pathological results showed that the distribution of USPIO was consistent with that of transplanted stem cells in myocardium. Conclusion: (1) the concentration of Cyi was 1.0 脳 10-6mol/L for 4 h, and the fluorescence intensity increased with the increase of the number of cells in vitro, which showed a linear relationship. 2Fluc could locally inject stem cells into myocardium of Bal b / c mouse myocardial infarction model. In vivo bioluminescent imaging with Cyi fluorescent dye could be used to trace the stem cells to transplanted stem cells in vitro. 3After implantation of BMSCs/Fluc labeled with USPIO into myocardial tissue of Bal b / c mice, the bioluminescence signal decreased gradually, indicating that stem cells died gradually, without proliferation, migration and teratoma formation. MRI can trace the BMSCs/Fluc labeled by USPIO in vivo and the pathological results show that the distribution of USPIO and transplanted stem cells in myocardium is the same as that of transplanted stem cells.
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R542.22

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