發(fā)布時(shí)間：2018-06-29 03:27

  本文選題：水母 + 觸手提取物　； 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2013年碩士論文

【摘要】：隨著水母爆發(fā)日益頻繁與人類涉�；顒�(dòng)的逐漸增多，有毒水母蜇傷已成為最常見的海洋生物傷，水母蜇傷患者可出現(xiàn)多種局部或全身癥狀。研究表明水母毒素是一類結(jié)構(gòu)新穎的肽類，具有溶血、心血管、肝腎、神經(jīng)和皮膚壞死等多種生物活性，其中溶血活性，即損傷紅細(xì)胞的效應(yīng)，是水母毒素中普遍存在的一類生物活性。水母種類不同，其毒素的溶血機(jī)制亦有所區(qū)別，目前關(guān)于水母毒素的溶血機(jī)制主要有孔道形成和酶活性兩種假說。我們推測，水母在億萬年的進(jìn)化過程中還可能形成其他“高效、直接”發(fā)揮毒性的方式，本文第一部分旨在探索孔道形成之外，脂質(zhì)過氧化損傷在發(fā)形霞水母（Cyanea capillata）觸手提取物（tentacle extract, TE）產(chǎn)生溶血過程中的作用。 水母蜇傷患者可分三種情況：極少數(shù)中毒非常嚴(yán)重，出現(xiàn)急性心衰而快速死亡；大多數(shù)患者中毒較輕，以蜇傷部位皮膚炎癥為主，只需局部處理；另有一部分患者中毒程度介于前兩者之間，可出現(xiàn)遲發(fā)的多器官功能損傷而需要住院治療。本課題組前期研究表明，中等劑量TE可以引起動(dòng)物延遲性的多器官損傷，而腎臟（尤其是腎小管）的急性損傷可能是TE致大鼠延遲死亡的主要原因。因此本文第二部分重點(diǎn)研究TE對腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）的損傷機(jī)制。受溶血機(jī)制研究結(jié)果的啟發(fā)，TE對NRK-52E細(xì)胞的損傷按照“脂質(zhì)過氧化—活性氧—線粒體—細(xì)胞凋亡”的思路來展開。 方法 第一部分：TE致紅細(xì)胞損傷（溶血活性）機(jī)制研究 首先，以0.45%紅細(xì)胞懸液為受試對象檢測TE溶血活性的劑量效應(yīng)關(guān)系，并檢測Ca~(2+)和Ca~(2+)通道阻斷劑地爾硫卓、維拉帕米、硝苯地平對TE溶血活性的影響。利用共聚焦顯微鏡觀察TE作用后紅細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度的變化，并觀察Ca~(2+)通道阻斷劑地爾硫卓的干預(yù)效應(yīng)。通過系列PEG滲透保護(hù)實(shí)驗(yàn)，研究孔道形成在TE溶血活性機(jī)制中的作用。將抗氧化劑預(yù)先與紅細(xì)胞孵育，檢測Vc和GSH對TE溶血活性的影響。通過檢測TE作用后紅細(xì)胞MDA水平，分析TE對紅細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化損傷效應(yīng)，并在整體動(dòng)物中，檢測抗氧化劑Vc對TE引起的體內(nèi)溶血和電解質(zhì)紊亂的影響。 第二部分：TE致NRK-52E細(xì)胞損傷機(jī)制初探 利用MTT法檢測不同濃度TE不同作用時(shí)間對NRK-52E細(xì)胞活力的影響，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。采用Annexin V-FITC/PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測TE作用后細(xì)胞凋亡與壞死情況。利用熒光探針DCFH-DA標(biāo)記技術(shù)觀察TE作用后細(xì)胞內(nèi)ROS水平，用TBA比色法檢測細(xì)胞MDA水平，Rhodamine123染色檢測線粒體膜電位的變化。 結(jié)果 第一部分：TE致紅細(xì)胞損傷（溶血活性）機(jī)制研究 TE對0.45%紅細(xì)胞懸液產(chǎn)生的溶血效應(yīng)具有劑量依賴性，產(chǎn)生50%溶血時(shí)TE濃度約為150μg/ml。Ca~(2+)能增強(qiáng)TE的溶血活性，而三種Ca~(2+)通道阻斷劑均能不同程度抑制TE的溶血活性。TE作用后，紅細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)明顯升高，而Ca~(2+)通道阻斷劑地爾硫卓可以部分拮抗TE作用后紅細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)升高的幅度。平均分子量超過4000的PEG可以抑制TE產(chǎn)生的溶血效應(yīng)。TE作用后紅細(xì)胞MDA水平隨TE劑量依賴性升高，，且抗氧化劑Vc和GSH均可以顯著拮抗TE的溶血活性；在體內(nèi)，Vc也可以降低TE引起的溶血程度以及血清中K+和Lac升高的幅度。 第二部分：TE致NRK-52E細(xì)胞損傷機(jī)制初探 TE對NRK-52E細(xì)胞活力的影響具有劑量和時(shí)間依賴性，TE作用后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，不再貼壁生長。隨TE濃度增大，凋亡和壞死的細(xì)胞增多。TE作用后，NRK-52E細(xì)胞胞內(nèi)ROS與MDA水平升高、線粒體膜電位降低。 結(jié)論 除了孔道形成之外，通過脂質(zhì)過氧化損傷紅細(xì)胞產(chǎn)生溶血也是TE可能的溶血機(jī)制；抗氧化劑Vc可以在體內(nèi)和體外兩個(gè)層面抑制TE的溶血活性，可以作為預(yù)防和治療水母蜇傷的候選藥物。 通過損傷粒體，導(dǎo)致線粒體膜電位降低，胞內(nèi)活性氧堆積，進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡與壞死是TE產(chǎn)生NRK-52E細(xì)胞毒性的機(jī)制之一。
[Abstract]:With the increasing frequency of jellyfish eruption and the increase of human involvement in the sea, toxic jellyfish stings have become the most common marine biological injuries. The jellyfish stings can occur in a variety of local or systemic symptoms. The study shows that the jellyfish toxin is a novel structure of peptides with a variety of organisms such as hemolysis, cardiovascular, liver and kidney, nerve and skin necrosis. The activity of hemolytic activity, that is, the effect of damage to red blood cells, is a kind of biological activity commonly found in the jellyfish toxin. The species of jellyfish are different, and the hemolysis mechanism of the toxin is also different. At present, the hemolysis mechanism of the jellyfish toxin mainly consists of two hypotheses of pore formation and enzyme activity. We speculate that the jellyfish is in the evolutionary process of hundreds of millions of years. Other "efficient, direct" forms of toxicity may also be formed. The first part of this article is to explore the role of lipid peroxidation damage in the process of hemolysis in the Cyanea capillata (tentacle extract, TE).
The jellyfish stings can be divided into three kinds of cases: very few intoxication is very serious, acute heart failure and rapid death; most patients are less toxic, with the main sting part of the skin inflammation, only local treatment, and another part of the patient's poisoning degree is between the former two, can be found late multiple organ function damage and need to be hospitalized. A preliminary study in our group showed that medium dose TE could cause delayed multiple organ damage in animals, and the acute injury of kidney (especially renal tubule) may be the main cause of delayed death in rats induced by TE. Therefore, the second part of this paper focuses on the damage mechanism of TE to renal tubular epithelial cells (NRK-52E). Inspired by the fruit, TE damages NRK-52E cells according to the idea of "lipid peroxidation - reactive oxygen - mitochondrion - cell apoptosis".
Method
Part one: mechanism of erythrocyte injury (hemolytic activity) induced by TE
First, 0.45% erythrocyte suspension was used to detect the dose effect relationship of TE hemolytic activity, and the effects of Ca~ (2+) and Ca~ (2+) channel blocker diltiazem, Vera Pammy, nifedipine on the hemolytic activity of TE were detected. The changes of Ca~ (2+) concentration in erythrocytes after TE were observed by confocal microscopy, and the blockage of Ca~ (2+) channel was observed. The intervention effect of diltiazem. Through a series of PEG permeation protection experiments, the role of pore formation in the hemolytic activity of TE was studied. The effects of Vc and GSH on the hemolytic activity of TE were detected by incubating the antioxidants with red blood cells in advance. The lipid peroxidation damage effect of TE to erythrocytes was analyzed by detecting the MDA level of erythrocytes after TE action, and the effects of lipid peroxidation on erythrocytes were analyzed. In vivo, the effects of antioxidant Vc on hemolysis and electrolyte disturbances induced by TE in animals were examined.
The second part is about the mechanism of NRK-52E cell injury induced by TE.
The effects of different concentrations of TE on the activity of NRK-52E cells were detected by MTT, and the morphological changes of cells were observed under the microscope. Annexin V-FITC/PI double staining was used to detect the apoptosis and necrosis of the cells after the action of TE. The ROS level of the cells after the action of TE was observed by the fluorescence probe DCFH-DA labeling technique, and TBA was used for TBA. The level of MDA was detected by colorimetry, and the changes of mitochondrial membrane potential were detected by Rhodamine123 staining.
Result
Part one: mechanism of erythrocyte injury (hemolytic activity) induced by TE
The hemolysis effect of TE on 0.45% erythrocyte suspension was dose-dependent. When 50% hemolysis was produced, the concentration of TE was about 150 mu g/ml.Ca~ (2+) enhanced the hemolytic activity of TE, while the three Ca~ (2+) channel blockers could inhibit the hemolytic activity of TE in varying degrees, and the Ca~ (2+) in the erythrocytes was significantly increased, and the Ca~ channel blocker diltiazem The increase of Ca~ (2+) in erythrocytes after the action of TE can be partially antagonized. The average molecular weight of more than 4000 of PEG can inhibit the increase of erythrocyte MDA level with the dose dependence of TE, and the antioxidant Vc and GSH can significantly antagonize the TE hemolytic activity after the effect of.TE on TE. In the body, Vc also reduces the hemolytic process. The extent of the increase of K+ and Lac in the serum.
The second part is about the mechanism of NRK-52E cell injury induced by TE.
The effect of TE on the activity of NRK-52E cells was dependent on the dose and time. The cell morphology changed after the action of TE and no longer adhered to the wall. As the concentration of TE increased, the intracellular ROS and MDA level of NRK-52E cells increased and the mitochondrial membrane potential decreased after the apoptosis and necrotic cells increased.TE.
conclusion
In addition to the formation of the channels, the hemolysis of erythrocytes by lipid peroxidation is a possible hemolytic mechanism of TE, and the antioxidant Vc can inhibit the hemolysis activity of TE in two levels in vivo and in vitro, and can be used as a candidate for the prevention and treatment of jellyfish stings.
It is one of the mechanisms of TE to produce NRK-52E cytotoxicity by damaging the mitochondria, resulting in the decrease of mitochondrial membrane potential, the accumulation of intracellular reactive oxygen species, and cell apoptosis and necrosis.
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R595.8

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本文編號：2080639