發(fā)布時(shí)間：2018-06-16 21:22

  本文選題：表皮干細(xì)胞 + CLC-3氯通道蛋白��； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：背景和目的:當(dāng)創(chuàng)傷發(fā)生時(shí),如果組織的完整和內(nèi)部平衡重建,體內(nèi)多種細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的路徑會(huì)被激活并相互協(xié)調(diào)(1)。研究發(fā)現(xiàn)表皮干細(xì)胞ESCs能夠從表皮或表皮與皮脂腺間毛囊處漏斗管遷移參與表皮修復(fù)(1-5)。然而對(duì)此創(chuàng)面愈合復(fù)雜生理過(guò)程的影響因素仍知之甚少。因?yàn)槿狈?duì)控制表皮干細(xì)胞體積和創(chuàng)傷后遷移運(yùn)動(dòng)影響因素的進(jìn)一步研究,這方面的研究知識(shí)很少。有研究報(bào)道在腫瘤發(fā)育和侵襲中,膜離子通道在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和凋亡中起重要作用(6)。電壓門控性鈉離子通道、鉀離子通道、鈣離子通道在乳腺癌(7)、黑色素瘤(8)、纖維肉瘤(9)的腫瘤侵襲和細(xì)胞遷移中起作用。氯離子通道是體內(nèi)最重要的陰離子通道,基于它的門控機(jī)制,氯離子通道可以被分成五個(gè)亞型,其中之一是容積激活性氯離子通道(VACC)(10)。容積激活性氯離子通道(VACC)對(duì)因受滲透性的細(xì)胞腫脹刺激產(chǎn)生的容積激活性氯離子電流變化(ICl,vol)負(fù)有責(zé)任。通過(guò)VACC的氯離子和鉀離子外流同鉀離子通道一起導(dǎo)致被稱為調(diào)節(jié)性體積減小(RVD)的細(xì)胞體積變小(11,12)。VACC變化已經(jīng)確定在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移中起重要作用(13,14)。盡管目前對(duì)于主要負(fù)責(zé)提供容積激活性氯離子電流(ICl,vol)的通道蛋白仍然不確定,CLC-3,作為電壓門控性氯離子通道CLC家族中的一員,是重要分子候選蛋白之一(15-17)。CLC-3是激活和調(diào)節(jié)容積激活性氯離子電流(ICl,vol)的分子成分(18,19)。在很多腫瘤細(xì)胞中它的蛋白表達(dá)得到確定,包括前列腺癌上皮細(xì)胞(20)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(21)、PC12細(xì)胞(22)和CNE-2Z細(xì)胞(23)。大量研究重點(diǎn)放在了氯離子通道的表達(dá)及其在細(xì)胞遷移和侵襲中發(fā)揮作用上。問(wèn)題是表皮干細(xì)胞上是否有CLC-3氯通道蛋白表達(dá),如果有,CLC-3氯通道蛋白是否通過(guò)容積激活性氯離子電流(ICl,vol)或調(diào)節(jié)性體積減小(RVD)來(lái)調(diào)節(jié)表皮干細(xì)胞的細(xì)胞體積變化。創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中表皮干細(xì)胞遷移時(shí)CLC-3氯通道蛋白作用也沒(méi)有在皮膚切除模型中研究過(guò)。因此,我們對(duì)表皮干細(xì)胞上CLC-3氯通道蛋白表達(dá)及容積激活性氯離子通道(VACC)功能作用進(jìn)行了研究,使用RNA干擾抑制CLC-3氯通道蛋白表達(dá)來(lái)評(píng)估CLC-3氯通道蛋白在表皮干細(xì)胞遷移中的作用。本課題主要就表皮干細(xì)胞遷移的“內(nèi)在動(dòng)力”作為切入點(diǎn),對(duì)clc-3氯通道蛋白在表皮干細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)中的作用進(jìn)行初步研究。我們對(duì)表皮干細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)中clc-3氯通道蛋白所起調(diào)節(jié)作用的研究,將有助于尋找介入表皮干細(xì)胞遷移的靶點(diǎn)和挖掘有效促進(jìn)創(chuàng)面愈合治療措施。方法:1在體外培養(yǎng)的正常大鼠表皮干細(xì)胞中提取總rna,并用rt-pcr方法檢測(cè)clc-3氯通道m(xù)rna在正常大鼠表皮干細(xì)胞上的表達(dá)。2westernblotting方法檢測(cè)clc-3蛋白在正常大鼠表皮干細(xì)胞上的表達(dá)。3在體外培養(yǎng)的正常大鼠表皮干細(xì)胞上經(jīng)過(guò)免疫熒光方法觀察clc-3氯通道蛋白是否表達(dá)。4免疫熒光方法檢測(cè)正常sd大鼠皮膚表皮干細(xì)胞分布情況及clc-3氯通道蛋白表達(dá)情況。免疫熒光雙標(biāo)染色觀察正常大鼠急性皮膚傷切除模型創(chuàng)面愈合過(guò)程中創(chuàng)緣表皮干細(xì)胞分布情況及clc-3氯通道蛋白表達(dá)情況。5clc-3過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染表皮干細(xì)胞及對(duì)表皮干細(xì)胞clc-3的影響。6clc-3過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的表皮干細(xì)胞容積敏感性氯電流變化情況。7clc-3過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染表皮干細(xì)胞對(duì)表皮干細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力的影響。8活細(xì)胞工作站技術(shù)動(dòng)態(tài)觀察clc-3過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染表皮干細(xì)胞后對(duì)表皮干細(xì)胞瞬時(shí)速度和運(yùn)動(dòng)軌跡長(zhǎng)度的影響。結(jié)果:1在體外培養(yǎng)的正常大鼠表皮干細(xì)胞中提取總rna,并用rt-pcr方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)clc-3氯通道m(xù)rna在正常大鼠表皮干細(xì)胞上表達(dá)。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn),陰性對(duì)照組無(wú)條帶,而表皮干細(xì)胞在電泳結(jié)果上出現(xiàn)一條特異擴(kuò)增條帶,位置為200bp,表明clc-3氯通道m(xù)rna在正常大鼠表皮干細(xì)胞上表達(dá)。2westernblotting方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)clc-3蛋白在正常大鼠表皮干細(xì)胞上表達(dá)。檢測(cè)到一條分子量為92kda的clc-3蛋白在正常大鼠表皮干細(xì)胞上的表達(dá)。3在體外培養(yǎng)的正常大鼠表皮干細(xì)胞經(jīng)過(guò)免疫熒光方法觀察發(fā)現(xiàn)clc-3氯通道蛋白在正常大鼠表皮干細(xì)胞上表達(dá)。可以看到胞膜、胞漿有紅色熒光的陽(yáng)性表達(dá),表明正常大鼠表皮干細(xì)胞上有clc-3氯通道蛋白表達(dá),定位于胞膜、胞漿。4免疫熒光方法檢測(cè)正常sd大鼠皮膚clc-3氯通道蛋白情況,我們選用一直被研究者公認(rèn)并采用的標(biāo)記物β1整合素作為escs的陽(yáng)性篩選標(biāo)記(綠色熒光),與clc-3氯通道蛋白共定位,結(jié)果顯示可見(jiàn)表皮基底層細(xì)胞排列規(guī)則,整齊,表皮基底層細(xì)胞體積正常,細(xì)胞漿熒光強(qiáng)度弱,胞膜、胞漿有紅色熒光的陽(yáng)性表達(dá)。表明正常大鼠皮膚表皮上有clc-3氯通道蛋白表達(dá)。免疫熒光雙標(biāo)染色觀察正常大鼠急性皮膚傷切除模型創(chuàng)面愈合過(guò)程中創(chuàng)緣表皮干細(xì)胞分布情況及clc-3氯通道蛋白的表達(dá),標(biāo)記物β1整合素作為escs的陽(yáng)性篩選標(biāo)記(綠色熒光),與clc-3氯通道蛋白(紅色熒光)共定位,致傷后1天,我們看到創(chuàng)緣部位表皮層沒(méi)有出現(xiàn)明顯的熒光增強(qiáng)現(xiàn)象,表皮層沒(méi)有增厚,但能夠在創(chuàng)緣附近表皮層中看到有少量膜熒光較強(qiáng)的細(xì)胞。致傷后3天時(shí),創(chuàng)緣胞膜熒光陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞明顯增多,創(chuàng)緣表皮層增厚。致傷后7天時(shí),創(chuàng)緣部位表皮基底層細(xì)胞形態(tài)仍不規(guī)則,依然處于旺盛的增殖分裂狀態(tài),創(chuàng)緣胞膜熒光陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞熒光略微減弱,創(chuàng)緣部位表皮層厚,細(xì)胞數(shù)量多。致傷后10天時(shí),創(chuàng)緣部位表皮基底層細(xì)胞排列逐漸緊密,細(xì)胞形態(tài)變得規(guī)則整齊,創(chuàng)緣胞膜熒光陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞熒光進(jìn)一步減弱,創(chuàng)緣部位表皮層變薄,細(xì)胞數(shù)量減少。5clc-3表達(dá)及抑制表達(dá)載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染表皮干細(xì)胞及對(duì)表皮干細(xì)胞clc-3的影響。熒光顯微鏡鏡下觀察表皮干細(xì)胞形態(tài)及感染效率,可以看到感染慢病毒的表皮干細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好,形態(tài)正常,rna干擾靶點(diǎn)病毒感染效率均高于90%。real-timepcr檢測(cè)最優(yōu)靶點(diǎn)mrna的敲除效率基因表達(dá)變化分析結(jié)果,westernblot檢測(cè)最優(yōu)靶點(diǎn)蛋白水平的敲除效率蛋白表達(dá)變化分析結(jié)果,轉(zhuǎn)染clcn3表達(dá)病毒后,clcn3蛋白水平有所上升。clcn3sh2和clcn3sh3都能有效降低clcn3氯通道蛋白表達(dá)水平,而clcn3sh1和control組相比對(duì)clcn3氯通道蛋白表達(dá)水平影響沒(méi)有顯著差異(p0.05),而clcn3sh2干擾序列能夠最有效的干擾clcn3基因的轉(zhuǎn)錄。clcn3sh2干擾序列能夠有效的抑制clcn3蛋白的表達(dá)。6clc-3過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的表皮干細(xì)胞容積敏感性氯電流變化情況。我們應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對(duì)表皮干細(xì)胞容積敏感性氯電流變化情況進(jìn)行了檢測(cè),我們對(duì)大鼠表皮干細(xì)胞等滲狀態(tài)下、lv-clc3-nc組、lv-clc3-overexpression組、lv-clc3-sh組大鼠表皮干細(xì)胞低滲狀態(tài)下的電壓-電流關(guān)系進(jìn)行了分析,當(dāng)lv-clc3-nc組、lv-clc3-overexpression組、lv-clc3-sh組大鼠表皮干細(xì)胞容積敏感性氯電流受低滲外液刺激被激活后,lv-clc3-overexpression組較lv-clc3-nc組、lv-clc3-sh組大鼠表皮干細(xì)胞不同鉗制電壓的電流值更高,波動(dòng)更明顯。而lv-clc3-sh組低于lv-clc3-nc組大鼠表皮干細(xì)胞不同鉗制電壓的電流值,波動(dòng)不明顯。我們對(duì)膜電位鉗制于+100mv時(shí)的細(xì)胞平均電流密度值進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,分析發(fā)現(xiàn),當(dāng)膜電位鉗制于+100mv時(shí),lv-clc3-nc組大鼠表皮干細(xì)胞容積敏感性氯電流平均電流密度值為722.77±21.57pa,lv-clc3-overexpression組大鼠表皮干細(xì)胞容積敏感性氯電流平均電流密度值為1257.39±41.58pa,顯著高于lv-clc3-nc組大鼠表皮干細(xì)胞容積敏感性氯電流平均電流密度值為722.77±21.57pa(p0.01)。lv-clc3-sh組大鼠表皮干細(xì)胞容積敏感性氯電流平均電流密度值為367.43±18.41pa,顯著低于lv-clc3-nc組大鼠表皮干細(xì)胞容積敏感性氯電流平均電流密度值為722.77±21.57pa和lv-clc3-overexpression組大鼠表皮干細(xì)胞容積敏感性氯電流平均電流密度值為1257.39±41.58pa(p0.01)。7clc-3過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染表皮干細(xì)胞對(duì)表皮干細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力的影響。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示,lv-clc3-nc組、lv-clc3-overexpression組、lv-clc3-sh組大鼠表皮干細(xì)胞的細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力是不同的,我們分別對(duì)lv-clc3-nc組、lv-clc3-overexpression組、lv-clc3-sh組大鼠表皮干細(xì)胞劃痕創(chuàng)面間距離比較進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,分析發(fā)現(xiàn),lv-clc3-nc組大鼠表皮干細(xì)胞劃痕創(chuàng)面間距離平均值為428.78±2.62μm,lv-clc3-overexpression組大鼠表皮干細(xì)胞劃痕創(chuàng)面間距離平均值為585.39±1.83μm,顯著高于lv-clc3-nc組大鼠表皮干細(xì)胞劃痕創(chuàng)面間距離平均值為428.78±2.62μm(p0.01)。lv-clc3-sh組大鼠表皮干細(xì)胞劃痕創(chuàng)面間距離平均值為316.89±2.43μm,顯著低于大鼠表皮干細(xì)胞劃痕創(chuàng)面間距離平均值為428.78±2.62μm和lv-clc3-overexpression組大鼠表皮干細(xì)胞劃痕創(chuàng)面間距離平均值為585.39±1.83μm(p0.01)。說(shuō)明lv-clc3-overexpression組大鼠表皮干細(xì)胞細(xì)胞表達(dá)clc-3增高,遷移運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng);而lv-clc3-sh組大鼠表皮干細(xì)胞表達(dá)clc-3降低,遷移運(yùn)動(dòng)能力減弱。細(xì)胞transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)lv-clc3-nc組、lv-clc3-overexpression組、lv-clc3-sh組大鼠表皮干細(xì)胞的細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力,我們分別對(duì)lv-clc3-nc組、lv-clc3-overexpression組、lv-clc3-sh組大鼠表皮干細(xì)胞進(jìn)入下室細(xì)胞數(shù)比較進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,分析發(fā)現(xiàn),lv-clc3-nc組大鼠表皮干細(xì)胞進(jìn)入下室細(xì)胞數(shù)平均值為209.11±2.47,lv-clc3-overexpression組大鼠表皮干細(xì)胞進(jìn)入下室細(xì)胞數(shù)平均值為282.50±2.57,顯著高于lv-clc3-nc組大鼠表皮干細(xì)胞進(jìn)入下室細(xì)胞數(shù)平均值209.11±2.47(p0.01)。lv-clc3-sh組大鼠表皮干細(xì)胞進(jìn)入下室細(xì)胞數(shù)平均值為163.50±2.79,顯著低于大鼠表皮干細(xì)胞進(jìn)入下室細(xì)胞數(shù)平均值為209.11±2.47和lv-clc3-overexpression組大鼠表皮干細(xì)胞進(jìn)入下室細(xì)胞數(shù)平均值為282.50±2.57(p0.01)。說(shuō)明lv-clc3-overexpression組大鼠表皮干細(xì)胞表達(dá)clc-3增高,遷移運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng);而lv-clc3-sh組大鼠表皮干細(xì)胞表達(dá)clc-3降低,遷移運(yùn)動(dòng)能力減弱。8活細(xì)胞工作站技術(shù)動(dòng)態(tài)觀察CLC-3過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染表皮干細(xì)胞后對(duì)表皮干細(xì)胞瞬時(shí)速度和運(yùn)動(dòng)軌跡長(zhǎng)度的影響�；罴�(xì)胞工作站(live cell station,LCS)動(dòng)態(tài)觀察Lv-CLC3-NC組、Lv-CLC3-over expression組、Lv-CLC3-sh組大鼠表皮干細(xì)胞運(yùn)動(dòng)情況,我們使用IMARIS軟件對(duì)活細(xì)胞工作站(live cell station,LCS)采集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,Lv-CLC3-NC組、Lv-CLC3-over expression組、Lv-CLC3-sh組大鼠表皮干細(xì)胞細(xì)胞運(yùn)動(dòng)瞬時(shí)速度變化情況。我們可以看到Lv-CLC3-over expression組大鼠表皮干細(xì)胞相比于Lv-CLC3-NC組大鼠表皮干細(xì)胞,在整個(gè)紀(jì)錄時(shí)間過(guò)程中,細(xì)胞運(yùn)行瞬時(shí)速度變化波幅大而強(qiáng)烈,說(shuō)明細(xì)胞活躍,運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)。Lv-CLC3-sh組大鼠表皮干細(xì)胞相比于Lv-CLC3-NC組大鼠表皮干細(xì)胞,在整個(gè)紀(jì)錄時(shí)間過(guò)程中,細(xì)胞運(yùn)行瞬時(shí)速度變化波幅小而和緩,波動(dòng)不明顯。說(shuō)明細(xì)胞運(yùn)動(dòng)瞬時(shí)速度在較低水平,運(yùn)動(dòng)能力受到抑制。我們使用IMARIS軟件對(duì)活細(xì)胞工作站(live cell station,LCS)采集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,Lv-CLC3-NC組、Lv-CLC3-over expression組、Lv-CLC3-sh組大鼠表皮干細(xì)胞6小時(shí)遷移運(yùn)動(dòng)軌跡長(zhǎng)度情況比較。我們可以看到Lv-CLC3-sh組大鼠表皮干細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)軌跡長(zhǎng)度114.11±10.75相比于Lv-CLC3-NC組大鼠表皮干細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)軌跡長(zhǎng)度224.43±13.07(P0.01)有顯著差異,說(shuō)明在紀(jì)錄時(shí)間過(guò)程中,細(xì)胞運(yùn)行遷移運(yùn)動(dòng)軌跡長(zhǎng)度降低。進(jìn)一步說(shuō)明細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力受到抑制。Lv-CLC3-over expression組大鼠表皮干細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)軌跡長(zhǎng)度278.95±29.21相比于Lv-CLC3-NC組大鼠表皮干細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)軌跡長(zhǎng)度224.43±13.07(P=0.128)無(wú)顯著差異,說(shuō)明在紀(jì)錄時(shí)間過(guò)程中,Lv-CLC3-over expression組細(xì)胞運(yùn)行遷移運(yùn)動(dòng)軌跡長(zhǎng)度升高并不明顯。結(jié)論:正常大鼠表皮干細(xì)胞表達(dá)CLC-3氯通道蛋白,過(guò)表達(dá)及抑制CLC-3表達(dá)能夠改變表皮干細(xì)胞因滲透壓變化引起的容積敏感性氯電流,起到調(diào)節(jié)表皮干細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力作用;在創(chuàng)面修復(fù)愈合過(guò)程中,創(chuàng)緣表皮CLC-3表達(dá)水平增高,提示CLC-3氯通道蛋白在調(diào)節(jié)表皮干細(xì)胞遷移參與創(chuàng)面修復(fù)中起重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R641

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9 廣e，

本文編號(hào)：2028153