發(fā)布時間：2018-05-29 02:55

  本文選題：創(chuàng)傷性腦損傷 + P-Cx43�。� 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury, TBI)是青壯年人群的主要死因，也是現(xiàn)代社會最主要的住院原因之一。外力損傷神經(jīng)元啟動一系列分子事件，導(dǎo)致腦組織水腫，神經(jīng)元死亡，運動和認(rèn)知功能受損。腦外傷后神經(jīng)元自噬激活，加劇了腦損傷及神經(jīng)功能缺失。神經(jīng)元自噬參與了腦損傷的病理進程，但是關(guān)于神經(jīng)元自噬的調(diào)控機制的研究甚少。目前國內(nèi)外研究主要集中于神經(jīng)元內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，關(guān)于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元自噬的調(diào)控以及神經(jīng)元自噬對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的影響未見報道。 近年來研究發(fā)現(xiàn)，TBI引起星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接蛋白（connexin, Cx）表達(dá)明顯升高，進而影響其形成的縫隙連接允許細(xì)胞內(nèi)小分子，離子及代謝物交換；TBI也引起星形膠質(zhì)細(xì)胞P2X7受體激活，導(dǎo)致腦水腫及神經(jīng)損傷；TBI所引起神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜上的谷氨酸轉(zhuǎn)運體1蛋白（glial glutamatetransporter1，GLT-1）表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞外興奮性氨基酸濃度升高，損傷神經(jīng)元。但是關(guān)于星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接蛋白如何調(diào)控P2X7受體及谷氨酸轉(zhuǎn)運體，從而導(dǎo)致神經(jīng)元自噬激活，影響突觸后電位的機制還未闡明。同時神經(jīng)元自噬激活是否對星形膠質(zhì)細(xì)胞的縫隙連接蛋白具有降解作用，從而自我調(diào)控，具有神經(jīng)保護功能，目前不得而知。本論文分三部分闡述。 第一部分大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷中海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞p-Cx43對神經(jīng)元自噬的調(diào)控 目的：本部分研究選用成年SPF級雄性SD大鼠應(yīng)用改良Marmarou法制備閉合性彌漫性顱腦創(chuàng)傷大鼠模型，給予p-Cx43特異性抑制劑甘珀酸（carbenoxolone, CBX）干預(yù)，檢測彌漫性腦創(chuàng)傷大鼠海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞中p-Cx43對神經(jīng)元自噬的影響。 方法：采用本實驗室改良Marmarou方法復(fù)制TBI大鼠模型。成年SPF級SD雄性大鼠192只數(shù)字隨機分組：①假手術(shù)組（Sham group）；②腦創(chuàng)傷組（TBI group）；③腦創(chuàng)傷+溶劑組（Saline group）；④腦創(chuàng)傷+Carbenoxolone組（CBX group）。取傷后3h、6h、24h、48h4個時間點檢測下列指標(biāo)：①HE染色觀察各組腦組織病理形態(tài)學(xué)改變；②免疫組織化學(xué)方法檢測海馬區(qū)p-Cx43和微管相關(guān)輕鏈-3（microtubule associatedprotein1light chain3，LC3）的蛋白定位表達(dá)；③Western-blot法檢測海馬區(qū)p-Cx43和LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)；④免疫熒光雙標(biāo)法檢測海馬區(qū)p-Cx43和LC3的蛋白共定位情況。應(yīng)用Image Proplus6.0，Image J和Image Lab 4.1分析系統(tǒng)進行定量分析測定。實驗中數(shù)據(jù)均用x s表示，用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，以P＜0.05，表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1光鏡下觀察大鼠腦創(chuàng)傷模型切片 1.1傷后大鼠腦組織大體觀察：傷后可見蛛網(wǎng)膜下腔出血以及少量腦室出血；腦實質(zhì)多見點狀出血，以腦干的背側(cè)多見，腦組織表面血管充血明顯，并可見腦組織腫脹及局部腦挫傷。1.2HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)的改變：Sham組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，神經(jīng)元數(shù)量多且形態(tài)正常；TBI24h組和Saline溶劑組神經(jīng)元胞體腫脹明顯，胞漿染色淺淡，核皺縮濃染，細(xì)胞與細(xì)胞之間出現(xiàn)間隙，神經(jīng)元出現(xiàn)變性及壞死改變。CBX治療組較TBI組和Saline溶劑組相比，神經(jīng)元胞體腫脹緩解，及核濃縮明顯減輕，神經(jīng)元周圍間隙明顯較小。 2海馬區(qū)p-Cx43和LC3免疫組化檢測結(jié)果 p-Cx43定位于海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜中，Sham組偶見陽性細(xì)胞，著色淺淡。TBI24h組和Saline溶劑組與Sham組比較，傷后p-Cx43陽性細(xì)胞顯著增多，著棕色加深，免疫反應(yīng)性增強（P0.05）。CBX治療組p-Cx43免疫反應(yīng)性明顯減弱（P0.05）；LC3定位于海馬區(qū)神經(jīng)元的胞質(zhì)，Sham組可見少量陽性細(xì)胞，且胞漿著色淺淡。TBI24h組和Saline溶劑組與Sham組比較，LC3陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，胞漿呈現(xiàn)深棕色，免疫反應(yīng)性明顯增強（P0.05）。與TBI組和Saline溶劑組相比，CBX治療組LC3免疫反應(yīng)性明顯減弱（P0.05）。 3海馬區(qū)p-Cx43和LC3的Western blot檢測結(jié)果 Sham組p-Cx43蛋白表達(dá)量在各時間點無變化；TBI組和Saline溶劑組p-Cx43蛋白表達(dá)量隨著傷后時間的推移，逐漸增高，與Sham組比較，傷后3h開始顯著升高（P＜0.05），6h達(dá)高峰，高表達(dá)狀態(tài)持續(xù)至傷后24h（P＜0.05）。CBX治療組各時間點蛋白表達(dá)趨勢與TBI和Saline組相似，但表達(dá)量明顯降低（P0.05）。Cx43總蛋白表達(dá)量在腦創(chuàng)傷后各時間點無變化。Sham組LC3Ⅱ的有微量的蛋白表達(dá)，且各時間點無差異；與Sham組相應(yīng)時間點比較，TBI組和Saline溶劑組LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），且呈現(xiàn)一定的動態(tài)變化趨勢，于損傷6h開始升高，24h達(dá)高峰，持續(xù)至傷后48h。CBX治療組各時間點蛋白表達(dá)趨勢與TBI和Saline組相似，但LC3Ⅱ表達(dá)量明顯降低（P 0.05）。4TBI后海馬區(qū)LC3與神經(jīng)元特異性標(biāo)記物（neuronal nuclei, NeuN）以及p-Cx43與星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物（glial fibrillary acidic protein，GFAP）熒光雙標(biāo)檢測結(jié)果 激光共聚焦顯微鏡下可見LC3為DyLight488標(biāo)記的細(xì)胞胞漿綠色熒光，NeuN為DyLight594標(biāo)記的細(xì)胞核周紅色熒光。可見海馬區(qū)綠色熒光與紅色熒光大部分重疊，呈現(xiàn)橙色聚集，并基本完全重合，說明自噬主要發(fā)生在神經(jīng)元。激光共聚焦顯微鏡下P-Cx43為DyLight488標(biāo)記的細(xì)胞胞漿綠色熒光，GFAP為DyLight594標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞紅色熒光，在海馬區(qū)重疊呈橙色聚集，說明P-Cx43定位于星形膠質(zhì)細(xì)胞。小結(jié)：改良的Marmarou彌漫性腦創(chuàng)傷模型滿足了本實驗對P-Cx43和LC3的研究；大鼠腦創(chuàng)傷后，P-Cx43和LC3蛋白表達(dá)持續(xù)升高，并且免疫反應(yīng)性增強，P-Cx43定位于海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞，LC3定位于海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞，給予縫隙連接阻斷劑CBX同時抑制P-Cx43和LC3蛋白表達(dá)及免疫反應(yīng)性，改善了腦損傷后神經(jīng)元腫脹及核濃縮，具有一定的神經(jīng)保護作用。 第二部分大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷中海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞p-Cx43通過激活P2RX7和下調(diào)GLT-1表達(dá)對神經(jīng)元自噬調(diào)控的分子機制研究 目的：p-Cx43如何通過P2RX7和谷氨酸轉(zhuǎn)運體GLT-1調(diào)控神經(jīng)元自噬，以及對海馬興奮性突觸后電位和空間學(xué)習(xí)記憶的影響。 方法：大鼠模型同上，將156只成年SPF級雄性SD大鼠隨機分成6組：①假手術(shù)組（n=36），②腦創(chuàng)傷組（n=66）③腦創(chuàng)傷24h+Saline溶劑組（n=24）④腦創(chuàng)傷24h+CBX抑制劑組（n=6）⑤腦創(chuàng)傷24h+OxATP抑制劑組（n=12）⑥腦創(chuàng)傷24h+Ceftriaxone組（n=12）。術(shù)后時間點同上。檢測①免疫組織化學(xué)法檢測海馬區(qū)P2X7、GLT-1的蛋白表達(dá)、定位；②激光共聚焦法檢測p-Cx43、P2X7、GLT-1的蛋白共定位情況；③Western-blot法檢測P2X7、GLT-1和LC3的蛋白表達(dá)量。另取30只大鼠隨機分為假手術(shù)組、腦創(chuàng)傷24h組，腦創(chuàng)傷24h+Saline溶劑組，腦創(chuàng)傷24h+CBX抑制劑組，腦創(chuàng)傷24h+3-MA（3-methyladenine）抑制劑組，記錄海馬腦片興奮性突觸后電位，Clampfit10.0檢測其長時程增強（LTP,long-term potentiation）的變化。再取30只大鼠行水迷宮測試，隨機分為假手術(shù)組、腦創(chuàng)傷14d組，腦創(chuàng)傷14d+Saline溶劑組，腦創(chuàng)傷14d+CBX抑制劑組，腦創(chuàng)傷14d+3-MA抑制劑組，檢測其空間學(xué)習(xí)記憶能力，使用Smart軟件記錄分析潛伏期。定量分析和統(tǒng)計同上。 結(jié)果： 1Morris水迷宮結(jié)果 使用Morris水迷宮檢測大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。TBI組和Saline溶劑組傷后第14d較Sham組相比大鼠搜索安全島潛伏期明顯延長（P0.05）。CBX抑制劑組和3-MA抑制劑組傷后第14d搜索安全島運動軌跡均較TBI組和Saline溶劑組明顯改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。 2長時程增強（LTP）結(jié)果 使用長時程增強檢測長時記憶有重要意義。TBI24h組和Saline溶劑組傷后興奮性突觸后電位幅度、斜率較Sham組均明顯降低、減小，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。CBX抑制劑組和3-MA抑制劑組傷后突觸后電位幅度、斜率均較TBI24h組和Saline溶劑組明顯增高、加大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P 0.05）。 3海馬區(qū)P2X7受體和GLT-1免疫組化檢測結(jié)果 P2X7受體定位于海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜上，Sham組可見陽性細(xì)胞，著棕色。TBI24h組和Saline溶劑組與Sham組比較，傷后P2X7受體陽性細(xì)胞無顯著增多（P0.05）。OxATP治療組P2X7受體免疫反應(yīng)性無明顯改變（P0.05）；GLT-1定位于海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞膜，Sham組可見陽性細(xì)胞，著棕色。TBI24h組和Saline溶劑組與Sham組比較，傷后GLT-1陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少，胞膜呈現(xiàn)淺棕色，免疫反應(yīng)性減弱（P0.05）。Cef治療組GLT-1免疫反應(yīng)性明顯增強（P 0.05）。 4腦創(chuàng)傷后24h海馬區(qū)P-Cx43、P2X7、GLT-1與GFAP的激光共聚焦檢測結(jié)果 海馬區(qū)p-Cx43為DyLight647標(biāo)記的陽性細(xì)胞胞漿紫色熒光，P2X7為DyLight488標(biāo)記的陽性細(xì)胞胞膜為綠色熒光，星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP為DyLight594標(biāo)記的紅色熒光，三色Merge呈黃色，說明p-Cx43、P2X7共定位于星形膠質(zhì)細(xì)胞；海馬區(qū)GLT-1為DyLight647標(biāo)記陽性細(xì)胞胞膜為紫色熒光，P2X7為DyLight488標(biāo)記陽性細(xì)胞胞膜為綠色熒光，星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP為DyLight594標(biāo)記紅色熒光，三色Merge呈黃色，說明GLT-1、P2X7也共定位于星形膠質(zhì)細(xì)胞。 5Western blot檢測結(jié)果 TBI24h組和Saline溶劑組與Sham組相比LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)量升高，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；TBI24h+CBX抑制劑組、OxATP抑制劑組、Ceftriaxone組LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)與TBI24h組和Saline溶劑組相比表達(dá)量下降，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。TBI組與Sham組比較，傷后6h GLT-1蛋白量顯著降低（P＜0.05），傷后24h達(dá)高峰；TBI24h組和Saline溶劑組與Sham組相比GLT-1的蛋白表達(dá)量降低，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；TBI24h+CBX抑制劑組、OxATP抑制劑組GLT-1的蛋白表達(dá)與TBI24h組和Saline溶劑組相比表達(dá)量升高，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。TBI組與Sham組比較，傷后P2X7蛋白量無顯著變化（P0.05）； TBI24h組和Saline溶劑組與Sham組相比P2X7的蛋白表達(dá)量無組間差異（P0.05）；TBI24h+CBX抑制劑組P2X7的蛋白表達(dá)與TBI24h組和Saline溶劑組相比組間無差異（P0.05）。 小結(jié)：大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷后海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞p-Cx43通過激活P2X7受體，下調(diào)GLT-1蛋白表達(dá)，，調(diào)控神經(jīng)元自噬，從而影響海馬區(qū)長時程記憶及空間學(xué)習(xí)記憶能力。 第三部分大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷中海馬區(qū)神經(jīng)元自噬對星形膠質(zhì)p-Cx43降解作用 目的：通過大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷中海馬區(qū)神經(jīng)元自噬對星形膠質(zhì)細(xì)胞p-Cx43降解機制的研究，闡明不但海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元具有調(diào)控作用，同時神經(jīng)元也對星形膠質(zhì)細(xì)胞具有一定調(diào)節(jié)作用。 方法：將120只成年雄性SD大鼠隨機分成4組：①假手術(shù)組（n=30），②腦創(chuàng)傷組（n=36）③腦創(chuàng)傷＋Saline溶劑組（n=24）④腦創(chuàng)傷＋3-MA抑制劑組（n=30）。每組又分別劃分為傷后3h、6h、24h、48h4個時間點。檢測①免疫熒光雙標(biāo)法檢測GFAP、LC3和p-Cx43的蛋白表達(dá)定位情況；②Western-blot法檢測LC3和P-Cx43的蛋白表達(dá)量；③透射電鏡檢測神經(jīng)元自噬體對縫隙連接的吞噬。分析和統(tǒng)計同前。 結(jié)果： 1海馬區(qū)LC3和p-Cx43的Western blot檢測結(jié)果 Sham組LC3Ⅱ/β-actin的比值在各時間點無變化；與Sham組比較，傷后6h開始TBI組LC3Ⅱ/β-actin的比值逐漸升高，24h達(dá)峰值，48h仍高表達(dá)，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；TBI組與Saline溶劑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；3-MA抑制劑組LC3Ⅱ/β-actin比值變化趨勢與TBI組相似，但比值明顯變小，傷后6h、24h和48h差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。p-Cx43的表達(dá)在TBI組各個時間點與Sham組比較，傷后3h開始升高，持續(xù)到傷后24h，組間蛋白量表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；TBI組與Saline溶劑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；3-MA抑制劑組p-Cx43明顯變大，與TBI組和Saline溶劑組比較 傷后6h和24h差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。2腦創(chuàng)傷后海馬區(qū)GFAP、LC3和p-Cx43的激光共聚焦檢測結(jié)果 海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP為DyLight488標(biāo)記的綠色熒光,LC3為DyLight673標(biāo)記的陽性細(xì)胞胞漿紫色熒光，p-Cx43為DyLight594標(biāo)記的陽性細(xì)胞胞漿紅色熒光，用DAPI行海馬區(qū)細(xì)胞藍(lán)色核染色。在sham組LC3紫色和P-Cx43紅色數(shù)量少；TBI組LC3紫色和p-Cx43紅色陽性強度都增加明顯；3-MA抑制劑組LC3紫色陽性強度較TBI組明顯減少，但p-Cx43紅色陽性強度較TBI組又明顯增加。LC3紫色主要定位于海馬區(qū)神經(jīng)元；P-Cx43紅色與GFAP綠色Merge成橙色分布于海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞。 3透射電鏡的檢測結(jié)果 我們使用透射電鏡對腦創(chuàng)傷24h后大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接超微結(jié)構(gòu)進行觀察顯示：神經(jīng)元細(xì)胞漿內(nèi)靠近縫隙連接處可見自噬溶酶體結(jié)構(gòu)。 小結(jié)：大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷后，抑制海馬區(qū)神經(jīng)元自噬導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞p-Cx43表達(dá)升高；透射電鏡可見海馬區(qū)神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接旁自噬溶酶體的存在。揭示大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷后海馬區(qū)神經(jīng)元自噬對星形膠質(zhì)細(xì)胞p-Cx43的表達(dá)具有降解作用。 結(jié)論： 大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷中海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞P-Cx43通過激活P2RX7和下調(diào)GLT-1表達(dá)，調(diào)控神經(jīng)元自噬，抑制這條通路改善了長時程增強和大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，同時我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元自噬能降解星形膠質(zhì)細(xì)胞p-Cx43，具有自我調(diào)控作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R651.15

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 馬爽;瑞舒伐他汀預(yù)處理對局灶性缺血再灌注大鼠自噬水平的影響[D];山東大學(xué);2015年

本文編號：1949220