本文選題：循環(huán)血miRNA + 生物標志物　； 參考：《華中科技大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景：微小RNAs (miRNAs)是一類相對新的內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼小RNA分子,它們可以通過結(jié)合到mRNA的3’非編碼區(qū)調(diào)控靶基因的表達。miRNAs已被證實在新陳代謝、細胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用。然而,成熟miRNAs結(jié)合到靶mRNA的特定區(qū)域?qū)е路g抑制或mRNA降解機制并未完全清楚闡明。現(xiàn)有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人類基因組編碼超過1000個的miRNAs,其表達有一定的組織或細胞類型特異性。研究表明,miRNAs已經(jīng)在廣泛的人類疾病中觀察到變化,包括自身免疫,炎癥,神經(jīng)變性和心血管疾病。在動物實驗研究中,大量證據(jù)表明心臟特異性miRNA,如miR-1, miR-133a/b和miR-208等,參與調(diào)控心臟發(fā)育及影響心血管疾病,包括急性心肌梗死(AMI)。最近的研究表明,無論是在人類和動物,一些miRNAs存在于體循環(huán)中。已有報道顯示一些循環(huán)miRNAs表達水平在懷孕期間和在多種癌癥或心血管疾病存在差異性。心血管系統(tǒng)疾病中,急性心肌梗死具有發(fā)病急、高死亡率等特點,因此實現(xiàn)AMI的早期診斷將具有重要的臨床價值。迄今,一些生物標志物已在診斷AMI中被應(yīng)用,例如,心肌肌鈣蛋白I (cTnI)、CK-MB等。但是,miRNAs在急性心肌梗死患者血漿中水平如何,是否可以提高診斷急性心肌梗死靈敏度或者特異性還較少研究。近來報道,冠狀動脈病或糖尿病引起的心肌損傷可以引起多種miRNA (miR-1, miR-133, miR-499, miR-208)在血循環(huán)的表達水平發(fā)生改變。 急性心肌梗死(AMI)是最嚴重的一種心血管疾病。早期,準確的診斷可以保證得到及時再灌注治療因此可以明顯減少死亡率。最近的研究表明,循環(huán)心肌源性的miRNAs可能是梗死的潛在生物標志物。最近有研究證明,在急性心肌梗死人和小鼠的血漿中miR-1, miR-133a/b,和miR-499-5p發(fā)生改變。這些結(jié)果表明miRNAs可參與心肌疾病的病理生理過程。然而,血循環(huán)miR-30a, miR-195, let-7b, miR-1和miR-126在急性心肌梗死的水平仍然是有待研究。 因此,我們將探討血循環(huán)中miR-30a, miR-195, let-7b, miR-1miR-126在急性心肌梗死發(fā)生過程中是否有顯著的表達差異、是否與急性心肌梗死過程密切相關(guān),以及作為實現(xiàn)對AMI早期診斷標志物的可能性。 研究方法：(1)本項目2009年10月至2010年5月獲得同濟醫(yī)院倫理委員會批準,在病人及家屬簽署了知情同意后執(zhí)行。(2)入選急性心肌梗死患者18名,健康成人30名作為對照。AMI患者的血液樣品在發(fā)病后4小時、8小時、12小時、24小時、48小時、72小時和1周分別采取外周靜脈血5ml；健康對照組同樣采血。離心法分離血漿并保持在-80℃直至RNA提取。(3)用TRIzol LS試劑提取總RNA；(4)用Real-Time PCR方法檢測血漿miRNA水平,用2-△△ct法計算相對于miRNAs的表達水平。(5)用ELISA方法測定血漿cTnI的濃度。(6)所有的統(tǒng)計分析均采用統(tǒng)計軟件SPSS13.0。獨立樣本T檢驗用于兩個組進行比較。其中"g3組參數(shù)比較采用重復(fù)測量ANOVA分析。對于分類變量,卡方檢驗。miRNAs與心肌肌鈣蛋白Ⅰ時間過程的趨勢是由重復(fù)測量方差分析。用ROC曲線下面積(AUC)測量來判斷miRNA診斷心肌梗死的特異性和敏感性。研究結(jié)果：(1)采用實時定量RT-PCR方法,我們分析了AMI患者和健康的成年人三種mi-RNAs (MIR-30A, miR-195和let-7b)的表達水平。結(jié)果顯示,急性心肌梗死患者和健康成人后4小時后miR-30a, miR-195和let-7b的表達顯著增高。在4小時,8小時和12小時,AMI患者血漿的miR-30a是對照組1.4倍,10.48倍和1.45倍。同樣,AMI組與對照組相比,在8小時和12小時,miR-195表現(xiàn)出10.2倍和1.4倍增長。miR-30a和miR-195在急性心肌梗死的血漿水平在各時間點進行比較,在8小時達到達高峰。(2)與血漿cTnI的比較分析顯示,在AMI患者中,miR-1, miR-126升高和cTnI顯著相關(guān),表現(xiàn)為相同的趨勢。(3)我們引入ROC曲線以確定miRNA診斷急性心肌梗死的特異性和敏感性。由于miRNA的表達水平的檢測可同時受技術(shù)和生物的變化的影響,我們用三個循環(huán)miRNA的組合的表達水平用一個單一的分數(shù),稱為復(fù)合體miRNA-得分,以提供一個改善信號。在8小時和12小復(fù)合的miRNA的平均得分在AMI組分別是2.93和2.96和對照組分別是1.53和1.56。該復(fù)合miRNA的分數(shù)來區(qū)分AMI組的能力,從對照組顯示通過ROC曲線為AUC0.93和0.92。通過使用1.815和2.025閾值分數(shù),進行了患者預(yù)測AMI,特異性為94%和90%,靈敏度為90%和90%。(4)這miR-1的分數(shù)和miR-126的分數(shù)代表了其在血漿的表達水平。在4小時,8小時,12小時,24小時,48小時和72小時,用miR-1的分數(shù)診斷急性心肌梗塞,其ROC曲線的AUC分別是0.92,0.90,0.94,0.92,0.96和0.90(圖3和表2)。在AMI組,我們?nèi)〉昧遂`敏度分別為93%,93%,94%,93%,93%和90%及特異性分別為90%,90%,93%,90%,90%和90%；miR-126的ROC曲線的AUC分別是0.86,0.87,0.88,0.87,0.84和0.83。AMI組,我們獲得了特異性分別為78%,84%,88%,77%,80%,70%以及靈敏度分別為81%,81%,81%,81%,81%和81%。 研究結(jié)論：我們的結(jié)果揭示血循環(huán)miR-30a, miR-195, let-7b, miR-1和miR-126表達水平的變化與經(jīng)典的心肌標志物cTnI一致,與心肌梗死密切相關(guān),因此具有用于診斷AMI的潛在臨床價值。 研究背景：在發(fā)達國家,中風(fēng)是導(dǎo)致人們死亡和殘疾的首要原因。其中,缺血性腦卒中約占中風(fēng)患者的80%。.而在中國,每年有2500000人患缺血性腦卒中并且約1000000死于腦卒中。與冠心病類似,傳統(tǒng)的腦卒中危險因素包括年齡、高血脂、高血壓、糖尿病、吸煙、酗酒等。miRNA是小分子非蛋白編碼RNA家族,通過調(diào)節(jié)mRNA的3’非翻譯區(qū)來調(diào)節(jié)靶基因的表達。研究證實,miRNA參與大量病理生理進程,例如：發(fā)育、分化、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移。然而,與腫瘤和心血管疾病相比,很少有研究報道m(xù)iRNA與腦死亡、變性、或缺血性腦卒中之間的聯(lián)系。近來研究發(fā)現(xiàn),在果蠅Dicer酶的缺乏,可發(fā)生神經(jīng)元的逐漸變性,而其靶基因miR-8則可以調(diào)節(jié)miRNA生成的關(guān)鍵環(huán)節(jié),從而阻止神經(jīng)元變性。此外,miR-146A/G等位基因也被證實和缺血性卒中相關(guān)。大鼠實驗研究發(fā)現(xiàn)miR-195可通過抗淀粉樣作用對慢性腦低灌注誘導(dǎo)的的老年性癡呆具有保護作用。 Jeya seelan等報道,miRNA可以參與調(diào)節(jié)SD大鼠大腦中動脈阻塞的病理生理機制。其研究發(fā)現(xiàn)在大腦中動脈阻塞24小時內(nèi)實現(xiàn)再灌注,miR-30a-3p的表達是下調(diào),而48小時再灌注,miR-30a-3p的表達則是上調(diào)。同時,最近研究表明miR-30家族可以調(diào)節(jié)血管的生成。此外,研究還發(fā)現(xiàn)在青年腦卒中的病人,miR-12表達水平出現(xiàn)明顯的下調(diào)。在神經(jīng)母細胞瘤細胞株,LIN28B和let-7這兩種miRNA的表達與rs17065417的基因型相關(guān)。而其他研究發(fā)現(xiàn)Let-7可以激活Toll-like受體7有助于神經(jīng)系統(tǒng)損傷的恢復(fù)。 急性心肌梗塞和缺血性腦卒中有著類似的病理生理過程,我們前期的研究表明,血漿miRNA濃度可能是心肌梗死的潛在標志物。在心肌梗塞早期階段我們檢測血循環(huán)miR-30a, miR-126和let-7b的表達水平發(fā)生異常改變,對診斷急性心肌梗死病人有高度的特異性和敏感性。然而,miR-30a, miR-126和let-7b是否參與了缺血性腦卒中病理生理進程以及其表達水平是否也發(fā)生改變還未見報道。 因此,我們將在本研究探討miR-30a, miR-126和let-7b在缺血性腦卒中發(fā)生過程中是否有顯著的表達差異,以及作為實現(xiàn)對缺血性腦卒中早期診斷的標志物的可能性。 研究方法：(1)本項目在獲得同濟醫(yī)院倫理委員會批準,病人及家屬簽署了知情同意書后執(zhí)行。我們從同濟醫(yī)院分別收集缺血性腦卒中和健康對照合計247例樣本,抽取5ml靜脈血作為研究標本。本研究病例為腦梗死患者,診斷是根據(jù)國際經(jīng)典診斷標準,影像學(xué)檢查是由經(jīng)驗豐富的神經(jīng)放射學(xué)專家確認。(2)用CT法分別計算并比較miRNA的相對表達水平。為了避免所提取RNA量存在差異,使用小核RNA(U6)作為內(nèi)參來對miRNA表達水平進行統(tǒng)一標準化。(3)相對miRNA的表達水平用2-△△CT法進行計算。獨立樣本T檢驗用于兩個組進行比較。對于分類變量采用卡方檢驗。一種復(fù)合得分(表示為miRNA表達水平總得分)定義來表示所述miRNA的累積水平。所述miRNA-得分分別為所有病例對照組內(nèi)樣品的miRNA表達水平的總和。所述miRNA的復(fù)合得分,并通過減去一個常數(shù)(最小得分)調(diào)整,以使所有分數(shù)中的最小值為0。并用ROC曲線(AUC)下面積作為判斷miRNA診斷腦梗死的特異性和敏感性的統(tǒng)計工具。所有的統(tǒng)計檢驗都采用P0.05(95%CI)作為統(tǒng)計學(xué)顯著差異水準。所有統(tǒng)計分析使用統(tǒng)計軟件SPSS13.0(Statistical Package for the Social Sciences,Chicago,111), 研究結(jié)果：(1)miRNA在缺血性腦卒中的表達水平：我們分別測量miR-30a,miR-126和let-7b在缺血性腦卒中和健康對照組的表達水平。研究發(fā)現(xiàn)miR-30a,miR-126和let-7b在48周和對照組沒有明顯差異,而在24小時,1周,4周和24周,同對照組相比,缺血性腦卒中患者miR-30a, miR-126表達下調(diào)。在24小時、1周、4周和24周,miR-30a在所有缺血性腦卒中組比對照組低45%-79%,而miR-26在所有缺血性腦卒中組比對照組低85%-98%。值得注意是我們的數(shù)據(jù)顯示let-7b在缺血性腦卒中患者血循環(huán)的表達水平在不同腦卒中亞型中并不相同。 (2) miRNA的特異性和敏感性：由于miRNA的表達可能會受技術(shù)和其他因素的影響,不同亞型的腦卒中所測定miRNA在同一時間點用一個分數(shù)來定義可能會因此具有不同偏差缺乏穩(wěn)定性。我們用miRNA分數(shù)代表let-7b-SA, let-7b-CEmb和let-7b-UDN的累計水平。與對照組比較,缺血性腦卒中的miRNA分數(shù)具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。為了確定miRNA診斷腦卒中的特異性和敏感性,我們引入ROC曲線進行分析研究。在24小時,1周,4周和24周,miR-30a的ROC的AUC分別是0.91(95%CI=0.869-0.979),0.91(95%CI=0.848-0.971),0.92(95%CI=0.856-0.976)和0.93(95%CI=0.875-0.984)。我們得到敏感性分別為94%,93%,90%,而特異性分別是80%,84%,84%和84%。MiR-126的ROC的AUC分別是0.92(95%CI=0.871-0.978),0.94(95%CI=0.895-0.985),0.93(95%CI=0.878-0.982)和0.92(95%CI=0.864-0.977)。診斷缺血性腦卒中的敏感性分別是92%,90%,92%和92%,特異性分別是84%,86%,84%和82%。Let-7b的ROC的AUC分別是0.93(95%CI=0.879-0.980),0.92(95%CI=0.866-0.98),0.92(95%CI=0.858-0.98)和0.91(95%CI=0.849-0.97)。因此用于診斷缺血性腦卒中的敏感性分別是92%,90%,92%和89%,特異性分別是84%,84%,86%和80%。 結(jié)論：缺血性腦卒中患者血循環(huán)miR-30a, miR-126和let-7b表達水平發(fā)生顯著的異常改變,提示miR-30a, miR-126和let-7可能具有作為診斷缺血性腦卒生物標志物的潛在臨床價值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R542.22

【參考文獻】

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本文編號：1936032