本文選題：創(chuàng)傷性腦損傷 + 線粒體　； 參考：《天津醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：目的:創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)相關凝血功能障礙(traumatic brain injury-associated coagulopathy,TBI-AC)發(fā)生和死亡率高,其發(fā)生機制尚不明確。課題組前期已發(fā)表的研究顯示,小鼠TBI后損傷的神經元和神經膠質細胞可釋放腦源性微粒(brain derived microparticles,BDMP)通過破壞的血腦屏障進入外周循環(huán)血中引起系統(tǒng)性凝血功能障礙(Blood 2015)。本研究將在此基礎上,繼續(xù)研究BDMP的亞型線粒體微粒(mitochondrial microparticles,mt MPs)在TBI后小鼠外周血中的含量及其在TBI-AC中的作用,并通過體外提取mt MPs,檢測其對凝血相關細胞的作用。同時檢測微粒清除蛋白Lactadherin對mt MPs介導的TBI-AC的治療作用。本研究將豐富TBI-AC發(fā)病機制的理論,并探索新的TBI-AC及TBI繼發(fā)性損傷的治療方法。方法:(1)通過小鼠TBI模型,檢測小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后外周血抗腦抗體的變化。(2)體外實驗檢測心磷脂(cardiolipin,CL)的促凝活性,并通過尾靜脈給予正常小鼠體內注射不同劑量的CL,檢測CL在正常小鼠體內的促凝作用。通過掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy,SEM)觀測CL形成膠團結構。(3)通過流式細胞術、RT-PCR和掃描電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)檢測小鼠TBI后外周血中mt MPs的釋放,同時檢測CL與mt MPs的關系。(4)通過流式細胞術,免疫磁珠分選和多步離心法三種不同方法體外提取mt MPs,并通過流式細胞術和TEM對其表型和形態(tài)進行鑒定。(5)體外檢測mt MPs的促凝作用,并通過小鼠尾靜脈給予正常小鼠體內注射mt MPs,通過凝血因子X激活凝血時間實驗,ELISA法檢測外周血D-dimer含量和組織病理染色,檢測mt MPs在正常小鼠體內的促凝作用。(6)通過流式細胞術和RT-PCR檢測體外培養(yǎng)的神經元和神經膠質細胞mt MPs的釋放。(7)檢測mt MPs或CL是否可以激活血小板及其潛在機制。(8)檢測mt MPs或CL對血管內皮細胞間屏障完整性和對內皮細胞的激活。(9)體外檢測Lactadherin蛋白對mt MPs介導的促凝作用的抑制作用。結果:(1)小鼠TBI后外周血中,在傷后10天開始可檢測到抗CL抗體,同時CL膠團在體內及體外具有促凝活性,其在體內可促進小鼠肺組織血管纖維素沉積和微血栓形成。(2)小鼠TBI后6h,檢測到腦組織中損傷的神經元和膠質細胞系中線粒體以微粒形式,即線粒體微粒(mt MPs)釋放至外周血中,其含量可達到17,547±2,677/μl,mt MPs表面暴露CL。這種mt MPs占到了整個Annexin V+微粒的55.2±12.6%。同時,體外培養(yǎng)的神經細胞系和膠質細胞系在凋亡狀態(tài)下可釋放mt MPs。體外提取的mt MPs可以協(xié)同血小板促進內皮細胞的滲漏。(3)正常小鼠經鼠尾靜脈注射入mt MPs 30min后,可導致小鼠外周血呈現(xiàn)高凝狀態(tài),凝血酶升高,同時可在小鼠肺組織中檢測到血管纖維素沉積及肺組織間水腫。(4)mt MPs介導的促凝作用主要是通過線粒體內膜上CL轉移至外膜而介導的,其促凝作用可以被微粒清除系統(tǒng)蛋白Lactadherin所阻斷,而這種mt MPs上的CL的促凝作用是相同濃度純化的CL膠團的1600倍。Lactadherin還可以減少經mt MPs注射小鼠的死亡率。結論:(1)TBI后損傷的神經細胞釋放mt MPs至外周循環(huán)血中,mt MPs表面含有大量CL(2)表面暴露CL的mt MPs具有高的促凝活性,其可以引起TBI后凝血功能障礙的發(fā)生。(3)微粒清除蛋白Lactadherin可以抑制CL和mt MPs的促凝作用,其還可以減少注射了mt MPs小鼠的死亡率。本研究揭示了一種新的表面暴露CL的mt MPs介導的TBI相關凝血功能障礙發(fā)生的機制,并初步探索了一種潛在的抑制這種促凝機制治療TBI-AC的方法。
[Abstract]:Objective: the occurrence and mortality of traumatic brain injury (TBI) related coagulation dysfunction (traumatic brain injury-associated coagulopathy, TBI-AC) and high mortality are not clear. Rain derived microparticles, BDMP) causes systemic coagulation dysfunction (Blood 2015) in peripheral circulation by destroying the blood brain barrier (Blood). On this basis, this study will continue to study the content of BDMP subtype mitochondrial particles (mitochondrial microparticles, MT MPs) in the peripheral blood of TBI mice and their role in TBI-AC. The effect of MT MPs on coagulation related cells was detected in vitro. The therapeutic effect of particle scavenging protein Lactadherin on TBI-AC mediated by MT MPs was also detected. This study will enrich the theory of TBI-AC pathogenesis and explore new therapeutic methods for secondary injury of TBI-AC and TBI. Methods: (1) detect mice through mouse TBI model. Change of anti brain antibody in peripheral blood after traumatic brain injury. (2) the activity of cardiolipin (cardiolipin, CL) was detected in vitro, and the normal mice were injected with different doses of CL through the tail vein to detect the procoagulant effect of CL in normal mice. The CL shape was observed by scanning electron microscopy (scanning electron microscopy, SEM). (3) the release of MT MPs in the peripheral blood of mice was detected by flow cytometry, RT-PCR and scanning electron microscopy (transmission electron microscopy, TEM), and the relationship between CL and MT MPs was detected. (4) three different methods were extracted by flow cytometry, immunomagnetic beads and multistep centrifugation. Phenotype and morphology were identified by cytometer and TEM. (5) the procoagulant effect of MT MPs was detected in vitro, MT MPs was injected into normal mice in the tail vein of mice, the coagulation time experiment was activated by coagulation factor X, D-dimer content in peripheral blood and histopathological staining were detected by ELISA method, and the procoagulant activity of MT MPs in normal mice was detected. Use (6) to detect the release of MT MPs in cultured neurons and glial cells by flow cytometry and RT-PCR. (7) whether MT MPs or CL can activate platelets and their potential mechanisms. (8) detection of the intercellular barrier integrity and activation of endothelial cells by MT MPs or CL. (9) detection of Lactadherin protein to MT MPs in vitro Results: (1) the anti CL antibody can be detected in the peripheral blood of mice after TBI, and the anti CL antibody can be detected at the beginning of the injury, and the CL micelles have the procoagulant activity in the body and in vitro, and it can promote the fibrin deposition and the formation of microthrombus in the lungs of the mice in the body. (2) the mice after TBI 6h, detect the injured nerves in the brain tissue. The mitochondria in the cell line and glial cell line are released to the peripheral blood in the form of microparticles, that is, mitochondrial particles (MT MPs). The content of the mitochondria is 17547 + 2677/ Mu L, and the MT MPs on the MT MPs surface is exposed to the MT MPs of the whole Annexin V+ particle, which is 55.2 + 12.6%.. The cultured neural cell lines and glial cell lines can be released in the apoptotic state. MT MPs extracted by S. in vitro can synergistically promote endothelial cell leakage. (3) normal mice injected into the tail vein of MT MPs 30min can lead to hypercoagulable state of peripheral blood and increase of thrombin in mice, and can detect vascular cellulose sedimentation and pulmonary edema in the lung tissue of mice. (4) MT MPs mediated coagulation effect It is mediated mainly through the transfer of the mitochondrial CL to the outer membrane, and its procoagulant action can be blocked by the particle scavenging system protein Lactadherin, and the CL on the MT MPs is 1600 times the CL micelle of the same concentration and can also reduce the mortality of the MT MPs injection mice. Conclusion: (1) after TBI, the injury was damaged. The release of MT MPs on the MT MPs surface containing a large number of CL (2) exposed CL MT MPs has a high procoagulant activity, which can cause the occurrence of coagulating dysfunction after TBI. (3) microparticle scavenging protein Lactadherin can inhibit the coagulation of CL and MT, which can also reduce the mortality of injected mice. The study revealed a new mechanism of MT MPs mediated TBI related coagulation dysfunction mediated by CL, and initially explored a potential method of inhibiting this anticoagulant mechanism for the treatment of TBI-AC.
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R651.15

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本文編號：1921197