發(fā)布時間：2018-04-30 16:02

  本文選題：生物信息學(xué) + PBMCs��； 參考：《吉林大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)是冠心病最嚴(yán)重的類型之一,是由冠狀動脈血管部分或完全閉塞所引起的部分心肌因持續(xù)性缺血、缺氧而導(dǎo)致的心肌組織局部壞死。2012年WHO報告顯示,全世界因心血管疾病死亡的患者有1750萬,2013年在我國由心血管疾病導(dǎo)致的350萬人死亡中,約有250萬(71%)是由心肌梗死導(dǎo)致的死亡。因此,心肌梗死已經(jīng)成為心血管疾病死亡的最主要原因。目的近幾十年,急性心肌梗死的治療已經(jīng)取得了重要進(jìn)步,然而急性心肌梗死仍是一類致死率極高的危重疾病。急性心肌梗死因具有病前期癥狀不明顯、突發(fā)性及致死率高等特點(diǎn),為預(yù)防、診斷和治療該疾病帶來一定難度,所以臨床上仍然需要能夠快速診斷和有效調(diào)控的理想生物標(biāo)志物。隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展,對來源于急性心肌梗死患者外周血芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行合理的分析和利用,能夠使人們在分子水平上更準(zhǔn)確地了解這一嚴(yán)重心臟疾病的發(fā)生與發(fā)展。利用基因芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析挖掘急性心肌梗死的潛在調(diào)控靶點(diǎn),能夠有效地了解該疾病的潛在誘因,明晰急性心肌梗死基因?qū)用嫔系陌l(fā)病機(jī)制,或可為該疾病的診斷和治療提供新的策略。本研究將結(jié)合生物信息學(xué)分析方法,對急性心肌梗死患者外周血芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行再次挖掘,通過篩選差異表達(dá)基因、分析功能與通路富集、基因間相互關(guān)系、基因共表達(dá)關(guān)系等方法,篩選急性心肌梗死的潛在調(diào)控靶點(diǎn),為進(jìn)一步分析急性心肌梗死的潛在調(diào)控靶點(diǎn)和可能的調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。課題組前期工作已經(jīng)證實(shí),曲古菌素A(trichostatin A,TSA)能夠抑制多種炎癥因子的產(chǎn)生和心肌細(xì)胞凋亡,對多種心臟疾病模型都有明顯療效。在急性心肌缺血大鼠模型中,TSA干預(yù)作用顯著,能夠減少心肌梗死面積,改善心臟功能,減輕炎癥程度,抑制心肌細(xì)胞凋亡,保護(hù)心肌組織結(jié)構(gòu)等功能[1],但其具體的調(diào)控機(jī)制仍不甚清晰。方法從GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫中下載數(shù)據(jù)GSE48060。這一數(shù)據(jù)來源于31例入院24h急性心肌梗死患者外周血樣本和21例健康對照樣本,對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理。1、篩選差異表達(dá)基因與構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)。采用Limma軟件包計算差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes,DEGs),設(shè)置篩選條件為:P-value0.05及Fold change1.2。基于Gene ontology(GO)database對DEGs進(jìn)行GO功能注釋分析;基于Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)對DEGs進(jìn)行Pathway富集分析;基于GO的層次結(jié)構(gòu)構(gòu)建基因功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò);基于Pathway間的相互調(diào)控關(guān)系,構(gòu)建信號通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò);基于KEGG數(shù)據(jù)庫對基因間相互作用構(gòu)建基因間相互作用網(wǎng)絡(luò);基于JASPAR數(shù)據(jù)庫構(gòu)建差異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。2、構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)及驗(yàn)證樞紐基因。計算每對差異表達(dá)基因間Pearson相關(guān)系數(shù)和K-core值,構(gòu)建差異基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò);基于權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(Weighted Gene Co-Expression Network Analysis,WGCNA)獲得基因模塊、權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)、樞紐基因及基因模塊的功能及通路富集分析結(jié)果。收集20例急性心肌梗死患者和15例健康對照者外周血樣本,經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證樞紐基因的表達(dá)水平。3、樞紐基因TBX21的臨床意義分析。結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果與臨床樣本驗(yàn)證結(jié)果,篩選出最為相關(guān)的樞紐基因TBX21。再次收集急性心肌梗死患者38例和健康對照者25例的外周血樣本,提取外周血單個核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)及分離血清,使用Elisa試劑盒檢測血清中IFN-γ和IL-4含量;采用RT-PCR檢測PBMCs中樞紐基因TBX21及與TBX21密切相關(guān)的GATA-3、IFN-γ和IL-4的mRNA水平。分析38例患者心肌損傷指標(biāo)、血常規(guī)炎癥細(xì)胞指標(biāo)、心血管疾病危險因素及冠脈狹窄積分,采用統(tǒng)計學(xué)方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,并與TBX21水平進(jìn)行相關(guān)性分析,以確定TBX21作為急性心肌梗死潛在調(diào)控靶點(diǎn)的可能性。4、動物模型驗(yàn)證樞紐基因TBX21表達(dá)。建立大鼠急性心肌梗死模型,結(jié)扎冠狀動脈左前降支的方法制備模型,1天、3天和7天后處死大鼠,腹主動脈取血并收集心臟;采用TTC染色法檢測心肌梗死面積;采用HE染色法觀察心肌組織形態(tài)變化;腹主動脈采血分離大鼠外周血單個核細(xì)胞,采集大鼠梗死心肌組織,RT-PCR檢測PBMCs和梗死心肌組織中TBX21和GATA-3mRNA的表達(dá)情況;Western-blot檢測大鼠心肌組織中TBX21蛋白表達(dá)情況;Elisa檢測心肌梗死大鼠血清中IFN-γ和IL-4表達(dá)情況。5、TSA干預(yù)實(shí)驗(yàn)。制備急性心肌梗死大鼠模型,給予曲古菌素A(TSA),檢測心肌梗死面積、心肌組織形態(tài)變化、血清中IFN-γ和IL-4表達(dá)、TBX21蛋白水平和大鼠心肌組織及PBMCs中TBX21和GATA-3 mRNA水平。結(jié)果1、分析GEO數(shù)據(jù)庫中下載的急性心肌梗死芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)GSE48060,急性心肌梗死組與健康對照組相比,共獲得差異表達(dá)基因551個,其中164個基因發(fā)生上調(diào),387個基因發(fā)生下調(diào)。對DEGs進(jìn)行GO和Pathway富集分析、構(gòu)建基因間相互作用網(wǎng)絡(luò)、基因功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及信號通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可知,當(dāng)急性心肌梗死發(fā)生會涉及以炎癥反應(yīng)為主的生物進(jìn)程(BP),包括:炎癥反應(yīng)(GO:0006954),趨化作用(GO:0006935),免疫反應(yīng)(GO:0006955);主要涉及的關(guān)鍵信號通路為趨化因子信號通路(PATH:04062)、Toll-樣受體信號通路(PHAT:04620)和JAK/STAT信號通路(PHAT:04630)等。2、使用急性心肌梗死組與健康對照組中的DEGs作為WGCNA的數(shù)據(jù)源進(jìn)行分析,共獲得4個與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞防御反應(yīng)、血小板激活及血液凝固等GO分類緊密相關(guān)的基因模塊(blue、brown、yellow和turquoise模塊);通過對模塊與炎癥及免疫反應(yīng)進(jìn)行相關(guān)性分析,確認(rèn)模塊blue和brown為炎癥模塊。構(gòu)建blue和brown模塊基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),綜合模塊基因的GS、MM和IC值、模塊基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的Degree和K-core值,以及參與炎癥及免疫反應(yīng)相關(guān)GO term的基因列表,篩選出候選樞紐基因。采用RT-PCR方法檢測20例急性心肌梗死患者與15例健康對照樣本的結(jié)果顯示,有8個樞紐基因在急性心肌梗死患者PBMCs中的表達(dá)變化趨勢與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致,且TBX21、AQP9、PRF1和NFIL3變化最為顯著;最后,根據(jù)差異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄因子及其靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),獲得TBX21為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心轉(zhuǎn)錄因子,由此推測TBX21與急性心肌梗死的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),可能成為急性心肌梗死的潛在生物標(biāo)志物及可能的調(diào)控靶點(diǎn)。3、38例急性心肌梗死患者與25例健康對照樣本檢測結(jié)果表明,與對照組相比,急性心肌梗死患者PBMCs中TBX21和GATA-3水平顯著下降;Elisa結(jié)果顯示,與對照組相比,急性心肌梗死患者血清中IFN-γ表達(dá)上調(diào),IL-4表達(dá)下調(diào)。TBX21的臨床意義分析提示,TBX21水平與冠狀動脈狹窄程度(Gensini積分)呈負(fù)相關(guān);與心血管疾病危險因素中的血肌酐、纖維蛋白原及甘油三酯密切相關(guān)。4、采用RT-PCR方法檢測急性心肌梗死大鼠心肌組織和PBMCs中TBX21mRNA的表達(dá)。與對照組相比,模型組大鼠心肌組織和外周血中TBX21mRNA水平顯著下降;Western-blot結(jié)果顯示,心肌組織中TBX21蛋白水平第一天顯著下降隨后緩慢恢復(fù);Elisa檢測結(jié)果顯示,急性心肌梗死大鼠血清中IFN-γ表達(dá)上調(diào),IL-4表達(dá)下調(diào)。上述分析結(jié)果與臨床樣本檢測結(jié)果相一致。5、TSA能夠上調(diào)急性心肌梗死大鼠心肌組織與PBMCs中TBX21mRNA水平;上調(diào)TBX21的蛋白表達(dá);TSA抑制急性心肌梗死大鼠血清中IFN-γ與IL-4的表達(dá)異常,能夠減少心肌梗死面積,減輕缺血損傷所致心肌組織形態(tài)變化。結(jié)論1、運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法篩選出與急性心肌梗死發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的候選樞紐基因,收集臨床樣本,驗(yàn)證結(jié)果表明有8個樞紐基因的表達(dá)變化趨勢與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致,分別是NCF4、AQP9、NFIL3、DYSF、GZMA、TBX21、PRF1和PTGDR。差異最為顯著的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子TBX21可能成為急性心肌梗死的潛在生物標(biāo)志物及可能的調(diào)控靶點(diǎn)。2、臨床樣本分析結(jié)果表明,TBX21水平與急性心肌梗死患者肌酐、纖維蛋白原、甘油三酯及冠脈狹窄程度顯著相關(guān)。3、急性心肌梗死大鼠模型中,TBX21 mRNA水平、蛋白水平顯著下降;TSA能夠恢復(fù)TBX21的表達(dá)異常。綜上,TBX21可能作為急性心肌梗死潛在調(diào)控靶點(diǎn)。
[Abstract]:Acute myocardial infarction ( AMI ) is one of the most serious types of myocardial infarction , which is caused by persistent ischemia and hypoxia caused by partial or complete occlusion of coronary artery . The expression of IFN - 緯 and IL - 4 in peripheral blood mononuclear cells ( PBMCs ) and isolated serum were analyzed by means of gene ontology ( GO ) database . The expression of TBX21 and GATA - 3 mRNA in serum of rats with acute myocardial infarction was detected by means of TTC staining . The expression of TBX21 and GATA - 3 mRNA was detected by Western - blot . The expression of TBX21 and IL - 4 in PBMCs of rats with acute myocardial infarction was detected by RT - PCR .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R542.22

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本文編號：1825210