本文選題：氨 + 肝細(xì)胞　； 參考：《鄭州大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景：肝功能衰竭(hepatic failure,HF)定義為由于嚴(yán)重而廣泛的肝細(xì)胞損傷導(dǎo)致的全身代謝功能發(fā)生紊亂的臨床綜合癥狀。常伴有大量肝細(xì)胞壞死、血氨的惡性升高、嚴(yán)重的消化道癥狀、黃疸迅速加深、出血、腦水腫和肺水腫甚至肝性腦病(hepatic encephalopathy,HE)[1]。肝性腦病病情嚴(yán)重、臨床癥狀復(fù)雜、病死率高,是嚴(yán)重的危害人們健康的肝臟疾病。而代謝紊亂引起的氨中毒學(xué)說一直在肝性腦病的發(fā)病機(jī)制中處于核心地位。同時(shí),氨在HE的診斷、治療中也有十分重要的作用。細(xì)胞凋亡與線粒體細(xì)胞的凋亡是在一系列調(diào)控基因的參與下精確有序完成的,與細(xì)胞的增殖相類似。總體來講,根據(jù)凋亡過程中是否有線粒體的參與,可將細(xì)胞的凋亡分為兩條主要途徑:一條是由細(xì)胞外信號激活細(xì)胞內(nèi)的caspase來完成的;另一條途徑是通過線粒體的激活誘導(dǎo)的caspase的釋放,而活化的caspase可降解細(xì)胞內(nèi)與代謝相關(guān)的重要蛋白,最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。在線粒體凋亡途徑中,細(xì)胞色素c(cyt c)從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中是凋亡發(fā)生的重要標(biāo)志。Cyt c激活釋放到細(xì)胞質(zhì)后可與Apaf-1、caspase-9的前體、ATP/d ATP形成凋亡體。凋亡體形成后募集并激活caspase-3,誘發(fā)caspases介導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng),最終發(fā)生凋亡。以往諸多研究證實(shí)線粒體MPT和線粒體上Bcl-2家族形成的跨膜通道介導(dǎo)了cyt c從線粒體到胞質(zhì)的釋放過程。在細(xì)胞凋亡或壞死時(shí),膜通道孔的開放顯著改變了線粒體的通透性線粒體內(nèi)容物通過膜孔道釋放到胞漿中。Ca2+過度進(jìn)入,線粒體還原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione Tablets,GSH)的氧化,和活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平的持續(xù)上升導(dǎo)致了膜通道的開放。過度開放的通道孔最終導(dǎo)致了線粒體Cyt c的釋放和膜電位的消失。在線粒體膜上,以腺苷轉(zhuǎn)位蛋白(ANT)和電壓依賴性的的陰離子通道(VDAC)這兩種蛋白為主組成了線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(m PTP孔),m PTP孔開放會(huì)引起線粒體跨膜電位下降和細(xì)胞色素c釋放,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。線粒體功能密切相關(guān)的通透性轉(zhuǎn)換孔(m PTP),ATP的合成,被認(rèn)為是與氨的濃度升高及ROS的產(chǎn)生有關(guān)[2]。最近的研究表明生理濃度的氨可以使培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中自由基的產(chǎn)生顯著增加[3]。在急性氨中毒的動(dòng)物模型中也顯示出超氧化物產(chǎn)生的增加和各種抗氧化酶活性的下降[4]。氧化應(yīng)激的后果之一就是導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜上以鈣離子依賴為特征的m PTP孔的開放。因此鈣離子濃度的改變可能是誘導(dǎo)m PTP孔開放的非常重要的原因。氧化應(yīng)激可通過啟動(dòng)膜脂質(zhì)過氧化來改變生物膜功能、或與生物大分子結(jié)合來破壞酶的活性等。在細(xì)胞因子(如TNF-α、NF-κB)的共同作用下不同程度的損傷肝細(xì)胞,所以抗氧化治療對防治肝臟疾病起著重要的作用。膽紅素的代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)膽紅素經(jīng)肝細(xì)胞的清除是一個(gè)復(fù)雜的過程,游離膽紅素(UCB)首先通過OATP1B1和OATP1B3被肝細(xì)胞攝取,再經(jīng)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(uridine-diphosphoglucuronosy transferase,UGT)的催化轉(zhuǎn)變?yōu)橹苯幽懠t素(DBIL),最終DBIL通過細(xì)胞表面的多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)排泄入膽汁。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UGT)是大部分脊椎動(dòng)物肝臟微粒體中最重要的II相生物轉(zhuǎn)化酶之一。其中UTG1A1和UTG1A5被稱為膽紅素的代謝群,而UGT1A1是催化膽紅素葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)的主要酶,而UTG1A5在肝臟中的含量甚微。膽紅素向細(xì)胞外的排泄過程嚴(yán)格依賴能量的供應(yīng)和MRP蛋白及GSH的參與。高氨血癥和黃疸是肝衰竭(HF)的常見臨床癥狀。在肝衰竭的治療過程中發(fā)現(xiàn):降氨的同時(shí)伴隨有膽紅素水平的下降。肝臟是體內(nèi)氨代謝的主要場所,出現(xiàn)血氨升高時(shí)出現(xiàn)的“肝細(xì)胞無能”現(xiàn)象是肝衰竭后的常見病理現(xiàn)象。但是肝細(xì)胞內(nèi)升高的氨如何影響肝細(xì)胞的病理生理過程?氨是否又促進(jìn)了肝細(xì)胞的凋亡?氨通過何種途徑影響了膽紅素的代謝或轉(zhuǎn)運(yùn)?既往高血氨損害星形膠質(zhì)細(xì)胞的機(jī)制很多,包括直接毒性作用,氧化應(yīng)激,線粒體通透性轉(zhuǎn)換和谷氨酰胺理論等。但關(guān)于氨如何加重肝細(xì)胞的損傷甚至凋亡的作用研究甚少。膽紅素的代謝過程與能量的消耗緊密相關(guān),而在許多肝性腦病模型中都證實(shí)氨對線粒體氧化損傷及能量代謝的干擾。目前證據(jù)提示氨可作用于線粒體中三羧酸循環(huán)和蘋果氨酸-天冬氨酸穿梭酶,導(dǎo)致ATP的生成不足,發(fā)生氧化應(yīng)激[5]。故推測氨可能抑制膽紅素代謝相關(guān)的酶或者干擾肝細(xì)胞的能量供給來阻斷膽紅素的代謝與轉(zhuǎn)運(yùn),從而導(dǎo)致其在體內(nèi)的堆積。而血氨升高時(shí)出現(xiàn)的膽紅素水平的升高亦可被認(rèn)為是組織處于氧化應(yīng)激狀態(tài)的標(biāo)志。既往已有文獻(xiàn)表明血氨與肝衰竭患者的并發(fā)癥及死亡率有很大程度的相關(guān)性,但并沒有研究指出氨在急性肝衰竭發(fā)病機(jī)制中的地位和作用,以及氨對肝細(xì)胞損傷的機(jī)制和對膽紅素的影響。本實(shí)驗(yàn)通過氨中毒的細(xì)胞模型的建立,揭示了氨通過對線粒體的損傷誘導(dǎo)了肝細(xì)胞的凋亡,通過阻斷細(xì)胞的能量供給進(jìn)而阻礙了膽紅素向細(xì)胞外的排泄為氨毒性的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。目的:目的：1.通過不同濃度的NH4CL對人張氏肝細(xì)胞chang liver的MTT實(shí)驗(yàn),初步證實(shí)氨對肝細(xì)胞的增殖毒性;2.通過相關(guān)指標(biāo)的檢測證實(shí)氨促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡的作用;3.揭示氨作用后肝細(xì)胞線粒體功能的損傷及氧化壓力的存在;5.證明氨是通過對ATP合成的抑制阻礙了MRP2蛋白介導(dǎo)的DBIL的外排過程。方法:方法：1.培養(yǎng)正常人肝細(xì)胞系chang liver,MTT法比較不同濃度的NH4CL(5、10、20和40 mmol/L)作用后,人張氏肝細(xì)胞chang liver的增殖是否受到影響;2.蛋白免疫印跡技術(shù)檢測氨作用后凋亡指標(biāo)PARP的完整性,細(xì)胞免疫熒光檢測caspase-3的激活,再結(jié)合TUNEL法多方面證實(shí)氨促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡的作用;3.Quantitative PCR檢測氨作用后p53、TNFR m RNA的表達(dá)排除外源性的凋亡途徑;4.流式細(xì)胞技術(shù)觀測抗氧化劑SOD和GSH作用后活性氧物質(zhì)ROS產(chǎn)生的變化,證明氨損傷過程中氧化壓力的存在。5.TEM下觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)的損傷和鈣黃綠素-AM熒光探針法記錄m PTP孔的開放情況;6.ELISA法測定肝細(xì)胞功能相關(guān)指標(biāo)ALT、AST、COX、ATP及氧化還原指標(biāo)GSH,并比較細(xì)胞內(nèi)外DBIL的變化;7.Quantitative PCR和Western blotting技術(shù)比較HO-1、UGT1A1和MRP2的m RNA和蛋白的表達(dá),證明氨對ATP合成的抑制阻礙DBIL向胞外的排結(jié)果：大于10 mmol/L的氯化銨作用于chang liver細(xì)胞時(shí),隨著時(shí)間的增加,其抑制率呈穩(wěn)定的上升趨勢,且光鏡下可觀察到細(xì)胞密度的降低和胞內(nèi)的空泡化現(xiàn)象;當(dāng)10 mmol/L氨作用于肝細(xì)胞48 h后PARP蛋白被剪切,同時(shí)caspase-3的激活和凋亡較明顯,而40 mmol/L時(shí)由于死亡細(xì)胞過多,TNFR1和p53的m RNA在氯化銨作用前后無顯著變化;10 mmol/L的氨處理chang liver細(xì)胞48 h后電鏡下可觀察到線粒體形態(tài)的改變:線粒體腫脹變圓,空泡變性,嵴紊亂;10 mmol/L NH4CL組的細(xì)胞上清液中12 h時(shí)GSH和ALT較對照組已出現(xiàn)顯著升高(p0.000 1和p0.000 1),COX的升高和ATP生成量的下降在氨作用后24 h出現(xiàn)(p0.000 1和p0.05),提示肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的損傷和氧化損傷的存在。而AST的顯著升高在氨作用48 h后才出現(xiàn),相對滯后;在10 mmol/L的NH4CL作用細(xì)胞24 h時(shí)圖上可見活性氧物質(zhì)ROS的量明顯增加,SOD和GSH作用后ROS產(chǎn)生量出現(xiàn)了一定程度的下降;SOD和GSH在一定程度上抑制了氨誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡作用;在10 mmol/L的NH4CL組,ATP的合成較對照組明顯下降;胞內(nèi)出現(xiàn)了DBIL的積累同時(shí)胞外DBIL的水平下降;10 mmol/L的NH4CL作用后,UGT1A1的m RNA和蛋白質(zhì)水平均較對照組升高,但是MRP2的水平卻出現(xiàn)了顯著的下降。而HO-1未發(fā)生顯著性變化。ATP的加入使MRP2的m RNA和蛋白水平出現(xiàn)了顯著的升高。結(jié)論:結(jié)論：1.10 mmol/L的氨誘導(dǎo)了肝細(xì)胞的凋亡且對肝細(xì)胞功能造成了明顯的損傷;2.氨造成了肝細(xì)胞線粒體的氧化損傷及m PTP孔的開放;3.氨通過內(nèi)源性的線粒體氧化損傷途徑誘導(dǎo)了肝細(xì)胞的凋亡;4.氨中毒的肝細(xì)胞中膽紅素的代謝和排泄受到影響;5.氨是通過阻斷能量供給影響膽紅素經(jīng)MRP2蛋白的排泄。
[Abstract]:Background : Hepatic failure ( HF ) is defined as a clinical comprehensive symptom of the disorder of systemic metabolic function caused by severe and extensive hepatic injury . It is often accompanied by a large number of hepatocellular necrosis , malignant increase of blood ammonia , severe digestive tract symptoms , rapid jaundice , hemorrhage , cerebral edema and pulmonary edema and even hepatic encephalopathy ( HE ) . 鑲濇，

本文編號：1808187