本文選題：氨 + 肝細胞　； 參考：《鄭州大學》2014年博士論文

【摘要】：研究背景：肝功能衰竭(hepatic failure,HF)定義為由于嚴重而廣泛的肝細胞損傷導致的全身代謝功能發(fā)生紊亂的臨床綜合癥狀。常伴有大量肝細胞壞死、血氨的惡性升高、嚴重的消化道癥狀、黃疸迅速加深、出血、腦水腫和肺水腫甚至肝性腦病(hepatic encephalopathy,HE)[1]。肝性腦病病情嚴重、臨床癥狀復雜、病死率高,是嚴重的危害人們健康的肝臟疾病。而代謝紊亂引起的氨中毒學說一直在肝性腦病的發(fā)病機制中處于核心地位。同時,氨在HE的診斷、治療中也有十分重要的作用。細胞凋亡與線粒體細胞的凋亡是在一系列調(diào)控基因的參與下精確有序完成的,與細胞的增殖相類似�？傮w來講,根據(jù)凋亡過程中是否有線粒體的參與,可將細胞的凋亡分為兩條主要途徑:一條是由細胞外信號激活細胞內(nèi)的caspase來完成的;另一條途徑是通過線粒體的激活誘導的caspase的釋放,而活化的caspase可降解細胞內(nèi)與代謝相關(guān)的重要蛋白,最終引發(fā)細胞凋亡。在線粒體凋亡途徑中,細胞色素c(cyt c)從線粒體釋放到細胞質(zhì)中是凋亡發(fā)生的重要標志。Cyt c激活釋放到細胞質(zhì)后可與Apaf-1、caspase-9的前體、ATP/d ATP形成凋亡體。凋亡體形成后募集并激活caspase-3,誘發(fā)caspases介導的級聯(lián)反應,最終發(fā)生凋亡。以往諸多研究證實線粒體MPT和線粒體上Bcl-2家族形成的跨膜通道介導了cyt c從線粒體到胞質(zhì)的釋放過程。在細胞凋亡或壞死時,膜通道孔的開放顯著改變了線粒體的通透性線粒體內(nèi)容物通過膜孔道釋放到胞漿中。Ca2+過度進入,線粒體還原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione Tablets,GSH)的氧化,和活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平的持續(xù)上升導致了膜通道的開放。過度開放的通道孔最終導致了線粒體Cyt c的釋放和膜電位的消失。在線粒體膜上,以腺苷轉(zhuǎn)位蛋白(ANT)和電壓依賴性的的陰離子通道(VDAC)這兩種蛋白為主組成了線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(m PTP孔),m PTP孔開放會引起線粒體跨膜電位下降和細胞色素c釋放,導致細胞凋亡。線粒體功能密切相關(guān)的通透性轉(zhuǎn)換孔(m PTP),ATP的合成,被認為是與氨的濃度升高及ROS的產(chǎn)生有關(guān)[2]。最近的研究表明生理濃度的氨可以使培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞中自由基的產(chǎn)生顯著增加[3]。在急性氨中毒的動物模型中也顯示出超氧化物產(chǎn)生的增加和各種抗氧化酶活性的下降[4]。氧化應激的后果之一就是導致線粒體內(nèi)膜上以鈣離子依賴為特征的m PTP孔的開放。因此鈣離子濃度的改變可能是誘導m PTP孔開放的非常重要的原因。氧化應激可通過啟動膜脂質(zhì)過氧化來改變生物膜功能、或與生物大分子結(jié)合來破壞酶的活性等。在細胞因子(如TNF-α、NF-κB)的共同作用下不同程度的損傷肝細胞,所以抗氧化治療對防治肝臟疾病起著重要的作用。膽紅素的代謝與轉(zhuǎn)運膽紅素經(jīng)肝細胞的清除是一個復雜的過程,游離膽紅素(UCB)首先通過OATP1B1和OATP1B3被肝細胞攝取,再經(jīng)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(uridine-diphosphoglucuronosy transferase,UGT)的催化轉(zhuǎn)變?yōu)橹苯幽懠t素(DBIL),最終DBIL通過細胞表面的多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)排泄入膽汁。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UGT)是大部分脊椎動物肝臟微粒體中最重要的II相生物轉(zhuǎn)化酶之一。其中UTG1A1和UTG1A5被稱為膽紅素的代謝群,而UGT1A1是催化膽紅素葡萄糖醛酸結(jié)合反應的主要酶,而UTG1A5在肝臟中的含量甚微。膽紅素向細胞外的排泄過程嚴格依賴能量的供應和MRP蛋白及GSH的參與。高氨血癥和黃疸是肝衰竭(HF)的常見臨床癥狀。在肝衰竭的治療過程中發(fā)現(xiàn):降氨的同時伴隨有膽紅素水平的下降。肝臟是體內(nèi)氨代謝的主要場所,出現(xiàn)血氨升高時出現(xiàn)的“肝細胞無能”現(xiàn)象是肝衰竭后的常見病理現(xiàn)象。但是肝細胞內(nèi)升高的氨如何影響肝細胞的病理生理過程?氨是否又促進了肝細胞的凋亡?氨通過何種途徑影響了膽紅素的代謝或轉(zhuǎn)運?既往高血氨損害星形膠質(zhì)細胞的機制很多,包括直接毒性作用,氧化應激,線粒體通透性轉(zhuǎn)換和谷氨酰胺理論等。但關(guān)于氨如何加重肝細胞的損傷甚至凋亡的作用研究甚少。膽紅素的代謝過程與能量的消耗緊密相關(guān),而在許多肝性腦病模型中都證實氨對線粒體氧化損傷及能量代謝的干擾。目前證據(jù)提示氨可作用于線粒體中三羧酸循環(huán)和蘋果氨酸-天冬氨酸穿梭酶,導致ATP的生成不足,發(fā)生氧化應激[5]。故推測氨可能抑制膽紅素代謝相關(guān)的酶或者干擾肝細胞的能量供給來阻斷膽紅素的代謝與轉(zhuǎn)運,從而導致其在體內(nèi)的堆積。而血氨升高時出現(xiàn)的膽紅素水平的升高亦可被認為是組織處于氧化應激狀態(tài)的標志。既往已有文獻表明血氨與肝衰竭患者的并發(fā)癥及死亡率有很大程度的相關(guān)性,但并沒有研究指出氨在急性肝衰竭發(fā)病機制中的地位和作用,以及氨對肝細胞損傷的機制和對膽紅素的影響。本實驗通過氨中毒的細胞模型的建立,揭示了氨通過對線粒體的損傷誘導了肝細胞的凋亡,通過阻斷細胞的能量供給進而阻礙了膽紅素向細胞外的排泄為氨毒性的進一步研究提供理論依據(jù)。目的:目的：1.通過不同濃度的NH4CL對人張氏肝細胞chang liver的MTT實驗,初步證實氨對肝細胞的增殖毒性;2.通過相關(guān)指標的檢測證實氨促進肝細胞凋亡的作用;3.揭示氨作用后肝細胞線粒體功能的損傷及氧化壓力的存在;5.證明氨是通過對ATP合成的抑制阻礙了MRP2蛋白介導的DBIL的外排過程。方法:方法：1.培養(yǎng)正常人肝細胞系chang liver,MTT法比較不同濃度的NH4CL(5、10、20和40 mmol/L)作用后,人張氏肝細胞chang liver的增殖是否受到影響;2.蛋白免疫印跡技術(shù)檢測氨作用后凋亡指標PARP的完整性,細胞免疫熒光檢測caspase-3的激活,再結(jié)合TUNEL法多方面證實氨促進肝細胞凋亡的作用;3.Quantitative PCR檢測氨作用后p53、TNFR m RNA的表達排除外源性的凋亡途徑;4.流式細胞技術(shù)觀測抗氧化劑SOD和GSH作用后活性氧物質(zhì)ROS產(chǎn)生的變化,證明氨損傷過程中氧化壓力的存在。5.TEM下觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)的損傷和鈣黃綠素-AM熒光探針法記錄m PTP孔的開放情況;6.ELISA法測定肝細胞功能相關(guān)指標ALT、AST、COX、ATP及氧化還原指標GSH,并比較細胞內(nèi)外DBIL的變化;7.Quantitative PCR和Western blotting技術(shù)比較HO-1、UGT1A1和MRP2的m RNA和蛋白的表達,證明氨對ATP合成的抑制阻礙DBIL向胞外的排結(jié)果：大于10 mmol/L的氯化銨作用于chang liver細胞時,隨著時間的增加,其抑制率呈穩(wěn)定的上升趨勢,且光鏡下可觀察到細胞密度的降低和胞內(nèi)的空泡化現(xiàn)象;當10 mmol/L氨作用于肝細胞48 h后PARP蛋白被剪切,同時caspase-3的激活和凋亡較明顯,而40 mmol/L時由于死亡細胞過多,TNFR1和p53的m RNA在氯化銨作用前后無顯著變化;10 mmol/L的氨處理chang liver細胞48 h后電鏡下可觀察到線粒體形態(tài)的改變:線粒體腫脹變圓,空泡變性,嵴紊亂;10 mmol/L NH4CL組的細胞上清液中12 h時GSH和ALT較對照組已出現(xiàn)顯著升高(p0.000 1和p0.000 1),COX的升高和ATP生成量的下降在氨作用后24 h出現(xiàn)(p0.000 1和p0.05),提示肝實質(zhì)細胞的損傷和氧化損傷的存在。而AST的顯著升高在氨作用48 h后才出現(xiàn),相對滯后;在10 mmol/L的NH4CL作用細胞24 h時圖上可見活性氧物質(zhì)ROS的量明顯增加,SOD和GSH作用后ROS產(chǎn)生量出現(xiàn)了一定程度的下降;SOD和GSH在一定程度上抑制了氨誘導的肝細胞凋亡作用;在10 mmol/L的NH4CL組,ATP的合成較對照組明顯下降;胞內(nèi)出現(xiàn)了DBIL的積累同時胞外DBIL的水平下降;10 mmol/L的NH4CL作用后,UGT1A1的m RNA和蛋白質(zhì)水平均較對照組升高,但是MRP2的水平卻出現(xiàn)了顯著的下降。而HO-1未發(fā)生顯著性變化。ATP的加入使MRP2的m RNA和蛋白水平出現(xiàn)了顯著的升高。結(jié)論:結(jié)論：1.10 mmol/L的氨誘導了肝細胞的凋亡且對肝細胞功能造成了明顯的損傷;2.氨造成了肝細胞線粒體的氧化損傷及m PTP孔的開放;3.氨通過內(nèi)源性的線粒體氧化損傷途徑誘導了肝細胞的凋亡;4.氨中毒的肝細胞中膽紅素的代謝和排泄受到影響;5.氨是通過阻斷能量供給影響膽紅素經(jīng)MRP2蛋白的排泄。
[Abstract]:Background : Hepatic failure ( HF ) is defined as a clinical comprehensive symptom of the disorder of systemic metabolic function caused by severe and extensive hepatic injury . It is often accompanied by a large number of hepatocellular necrosis , malignant increase of blood ammonia , severe digestive tract symptoms , rapid jaundice , hemorrhage , cerebral edema and pulmonary edema and even hepatic encephalopathy ( HE ) . 鑲濇，

本文編號：1808187