本文選題：Hepcidin　切入點(diǎn)：腺病毒科　出處：《浙江大學(xué)》2013年碩士論文

【摘要】：研究目的： 構(gòu)建含Hepcidin基因重組腺病毒干擾真核表達(dá)載體Pad-hepc-shRNA-GFP,并驗(yàn)證其門靜脈注射途徑的干預(yù)效果。 實(shí)驗(yàn)方法： 1) Pad-hepc-shRNA-EGFP的構(gòu)建：根據(jù)Hepcidin基因在genbank的序列,設(shè)計(jì)相應(yīng)的siRNA,通過設(shè)計(jì)構(gòu)架oligo,合成shRNA序列。設(shè)計(jì)并合成1對(duì)互補(bǔ)的含shRNA序列的寡聚單鏈DNA,按一定的體系退火形成DNA雙鏈,然后用載體構(gòu)建試劑盒BLOCK-iT U6RNAi Entry Vector Kit (invitrogen, Catalog nos. K4944-00)進(jìn)行重組克隆,將退火而成的雙鏈shRNA oligo插入shRNA表達(dá)載體pENTR/U6vector中,按照一定的連接體系,構(gòu)建shRNA表達(dá)質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5a孵育,小量質(zhì)粒抽提并且測(cè)序。設(shè)計(jì)引物、運(yùn)用特定的酶切體系,對(duì)于構(gòu)建的pENTR/U6載體進(jìn)行改造,連入CMV啟動(dòng)子和熒光蛋白GFP,然后使用Invitrogen公司的LR重組系統(tǒng)將改造好的載體和pAd/BLOCK-IT-DEST重組,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α孵育,篩選并測(cè)序,驗(yàn)證Pad-hpec-shRNA-EGFP(?)建成功。用構(gòu)建的腺病毒載體Pad-hepc-shRNA-EGFP經(jīng)Pac I消化后轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞,包裝病毒,收集初級(jí)病毒液,二次擴(kuò)增,收集病毒原液并測(cè)定滴度,備用。 2)經(jīng)小鼠門靜脈注射干擾病毒：對(duì)正常balb/c小鼠麻醉后,行門靜脈注射載體病毒量2.7109ifu/ml/500ul,正常喂養(yǎng)10d后,取肝臟標(biāo)本,通過半定量PT-PCR法檢測(cè)小鼠肝臟Hepcidin基因的表達(dá)情況。對(duì)照組取正常小鼠肝臟標(biāo)本檢測(cè)Hepcidin基因的表達(dá)情況。 研究結(jié)果： 經(jīng)過基因測(cè)序證明,腺病毒重組載體Pad-hepc-shRNA-EGFP中包含的基因片段與目的基因一致,成功構(gòu)建了含Hepcidin基因重組腺病毒干擾真核表達(dá)載體,經(jīng)過包裝、擴(kuò)增,并獲得了滴度為2.7109ifu/ml腺病毒液。病毒門靜脈注射后,實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟Hepcidin mRNA表達(dá)為1.30±0.53,明顯低于對(duì)照組(6.39±1.00),充分顯示出了門靜脈注射此載體能夠?qū)epcidin基因的有效的抑制。 結(jié)論： 門靜脈注射Hepcidin基因特異性重組腺病毒干擾載體Pad-hepc-shRNA-EGFP能夠有效抑制小鼠Hepcidin基因的表達(dá)。
[Abstract]:Objectives of the study:The recombinant adenovirus interference eukaryotic expression vector Pad-hepc-shRNA-GFPFP containing Hepcidin gene was constructed and its effect on portal vein injection was verified.Experimental methods:1) the construction of Pad-hepc-shRNA-EGFP: according to the sequence of Hepcidin gene in genbank, the corresponding siRNAs were designed, and the shRNA sequence was synthesized by the framework of oligo.A pair of complementary oligonucleotides containing shRNA sequences were designed and synthesized, and DNA double strands were synthesized by annealing in a certain system. Then the kit BLOCK-iT U6RNAi Entry Vector Kit was constructed by using vector to construct BLOCK-iT U6RNAi Entry Vector Kit invitrogen, Catalog nos.K4944-00) was cloned into the shRNA expression vector pENTR/U6vector by inserting the annealed double-stranded shRNA oligo. According to a certain ligation system, the shRNA expression plasmid was constructed. The shRNA expression plasmid was transformed into the receptive cell DH5a incubated, and a small number of plasmids were extracted and sequenced.Primer was designed, and the constructed pENTR/U6 vector was modified with specific enzyme digestion system. The recombinant vector was linked to CMV promoter and fluorescent protein GFP. then the transformed vector and pAd/BLOCK-IT-DEST were recombined by LR recombination system of Invitrogen Company, and then transformed to DH5 偽 cells.Pad-hpec-shRNA-EGFPN was screened and sequenced to verify Pad-hpec-shRNA-EGFP.The building was successful.The recombinant adenovirus vector Pad-hepc-shRNA-EGFP was digested by Pac I and transfected into 293A cells. The virus was packaged, the primary virus solution was collected, the virus was amplified twice, the titer of the virus was collected and the titer was measured.2) injecting interfering virus through portal vein of mice: after anaesthesia to normal balb/c mice, the volume of vector virus was 2.7109 ifuml / r / 500ul.After normal feeding for 10 days, the liver samples were taken and the expression of Hepcidin gene in the liver of mice was detected by semi-quantitative PT-PCR method.The expression of Hepcidin gene in normal mouse liver was detected in the control group.Results of the study:It was proved by gene sequencing that the recombinant adenovirus vector Pad-hepc-shRNA-EGFP contained the same gene fragment as the target gene. The recombinant adenovirus containing Hepcidin gene interference eukaryotic expression vector was successfully constructed. After packaging, amplification, and titer of 2.7109ifu/ml adenovirus solution was obtained.After portal vein injection, the expression of Hepcidin mRNA in liver of experimental group was 1.30 鹵0.53, which was significantly lower than that of control group (6.39 鹵1.00), which showed that portal vein injection of the vector could effectively inhibit the expression of Hepcidin gene.Conclusion:Portal vein injection of Hepcidin gene specific recombinant adenovirus interference vector Pad-hepc-shRNA-EGFP can effectively inhibit the expression of mouse Hepcidin gene.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R459.7

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3 馬s，

本文編號(hào)：1719426