本文選題：全骨髓貼壁法　切入點：NF-κB　出處：《西南醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：研究目的:采用全骨髓貼壁法篩選大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,并進行傳代培養(yǎng)及鑒定,同時制備急性肝衰竭伴內(nèi)毒素血癥模型大鼠,通過觀察清熱解毒涼血化瘀中藥聯(lián)合BMSCs移植對模型大鼠肝組織中TNF-α、iNOS的基因轉(zhuǎn)錄及肝組織中核因子NF-κB表達的影響來探討該聯(lián)合方法對急性肝衰竭時炎癥反應(yīng)的作用機制。研究方法:1.大鼠BMSCs分離、培養(yǎng)及傳代篩選:無菌條件下取出大鼠雙側(cè)股骨及脛骨,并在超凈工作臺中沖洗出骨髓,接種于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中,定期換液,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況,并對所培養(yǎng)的細胞進行鑒定。2.急性肝衰竭大鼠模型的建立并驗證取體重約為180g-200g健康級SD雄性大鼠,硫代乙酞胺(TAA)以400mg/(kg·d)的劑量灌胃,間隔24h后重復(fù)給藥1次。設(shè)置正常組,給予2ml生理鹽水灌胃。造模48h后將存活的大鼠采血、取肝,以檢測血清肝功指標和血漿內(nèi)毒素水平,制作肝組織病理切片,鏡下觀察肝臟結(jié)構(gòu)及炎性細胞浸潤情況,對比正常組,以驗證造模是否成功。3.急性肝衰竭大鼠實驗分組及干預(yù)體重約為180g-200g健康級SD雄性大鼠60只,隨機分為正常組(A組)、TAA模型組(B組)、TAA+甘草酸苷治療組(C組)、TAA+中藥治療組(D組)、TAA+BMSCs治療組(E組)、TAA+BMSCs+中藥組治療組(F組),每組10只。b組、c組、d組、e組、f組給予400mg/kgtaa灌胃,間隔24h后重復(fù)給藥1次,制備alf大鼠模型。a組給予2ml生理鹽水灌胃。第2次灌胃后將bmsc(約1x107個細胞/只)經(jīng)尾靜脈注射到e、f組大鼠體內(nèi),a、b、c、d組大鼠經(jīng)尾靜脈注射等體積的用于培養(yǎng)bmsc的培養(yǎng)液,24h后重復(fù)尾靜脈注射1次。第1次尾靜脈注射后立即予以d、f組大鼠茵陳四苓顆粒灌胃;c組予以甘草酸苷灌胃;a組、b組、e組予以等體積蒸餾水灌胃。干預(yù)治療72h后采血、取肝,檢測血清肝功指標、血漿內(nèi)毒素含量;免疫組化法檢測肝組織中nf-κb的表達;rt-pcr法檢測肝組織tnf-α、inos的基因轉(zhuǎn)錄情況。研究結(jié)果:1.成功分離出貼壁生長的細胞,經(jīng)過3次傳代篩選后細胞形態(tài)逐漸趨向一致,以梭形為主,呈旋渦狀、網(wǎng)狀或放射狀排列。p3代細胞經(jīng)流式細胞儀鑒定結(jié)果顯示:cd29、cd44細胞陽性率分別為98.2%和97.9%,而cd34、cd45細胞陽性率分別為12.9%和18.7%,符合骨髓間充質(zhì)干細胞表面抗原表達的特點。2.急性肝衰竭模型的驗證:taa模型組血清ast、alt及血漿內(nèi)毒素水平較正常組均明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。taa模型組肝組織he染色顯示:肝索結(jié)構(gòu)大部分被破壞,肝細胞出現(xiàn)片狀壞死、凋亡,大量炎癥細胞浸潤。正常組肝組織he染色:肝組織細胞排列規(guī)律,結(jié)構(gòu)規(guī)整,細胞形態(tài)正常,無炎癥細胞浸潤。3.急性肝衰竭模型大鼠經(jīng)干預(yù)后的情況:(1)alt、ast及內(nèi)毒素水平結(jié)果顯示:采取治療的4組(c、d、e、f)大鼠血清ast、alt及血漿內(nèi)毒素水平明顯低于模型組(b組),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01);但各治療組與正常組(a組)對比,ast、alt、內(nèi)毒素水平仍高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01);各治療組相比較,f組大鼠血清ast、alt及血漿內(nèi)毒素水平較c、d、e組低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01);c、d、e三組之間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。(2)rt-pcr結(jié)果顯示:a組肝組織中有少量tnf-α、inos的基因轉(zhuǎn)錄。b、c、d、e、f組與a組相比,tnf-α、inos的基因轉(zhuǎn)錄水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。采取治療措施的c、d、e、f組大鼠肝組織中tnf-α、inos的基因轉(zhuǎn)錄水平均明顯低于模型組(b組),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01);各治療組間比較,f組tnf-α、inos的基因轉(zhuǎn)錄水平較c、d、e三組低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01);c、d、e三組tnf-α、inos的基因轉(zhuǎn)錄水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。(3)免疫組化結(jié)果顯示:a組肝組織有少量細胞的胞質(zhì)或胞核內(nèi)可見nf-κb的表達。灌胃taa的其他五組與a組相比較,表達nf-κb的細胞數(shù)目明顯增多,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。經(jīng)干預(yù)后,各治療組(c、d、e、f組)與模型組(b組)相比,nf-κb表達明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01),與a組相比,nf-κb表達仍然很高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。各治療組間比較,f組表達nf-κb的細胞數(shù)目較c、d、e組有所減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),而c、e、f三組表達nf-κb的細胞數(shù)目相近,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。研究結(jié)論:1.采用全骨髓培養(yǎng)法可成功獲得較高純度的bmscs,且該方法簡便、快捷、經(jīng)濟,可作為實驗室分離提取bmscs的常用方法。2.以400mg/(kg·d)劑量的TAA灌胃,每天1次,共灌胃2天,能夠成功建立急性肝衰竭伴內(nèi)毒素血癥大鼠模型。3.肝衰竭時茵陳四苓顆粒、BMSCs移植均能夠降低血漿內(nèi)毒素含量,兩者聯(lián)合效果更明顯。4.肝衰竭時陳四苓顆粒、BMSCs移植均能夠抑制NF-KB的激活,兩者聯(lián)合效果更明顯。5.肝衰竭時茵陳四苓顆粒、BMSCs移植均能夠減少炎性因子TNF-α、iNOS生成減少,兩者聯(lián)合效果更明顯6.茵陳四苓顆粒聯(lián)合BMSCs移植能夠明顯減輕肝衰竭時肝內(nèi)失控性炎癥反應(yīng),其機制可能是與減少內(nèi)毒素的生成及吸收,抑制炎癥信號通路NF-KB激活,從而減少其下游炎性因子TNF-α、iNOS生成有關(guān),且兩者具有協(xié)同作用。
[Abstract]:Objective: To study the method of whole bone marrow adherent screening of rat bone marrow mesenchymal stem cells, and subculture and identification, and preparation of acute liver failure with endotoxemia rat model, through the observation of detoxification of liangxuehuayu decoction combined with BMSCs transplantation on liver tissue in a rat model of TNF- alpha, iNOS gene transcription and liver tissue NF- expression of nuclear factor kappa B to explore the influence mechanism of the combined method of inflammatory reaction in acute liver failure. Methods: 1. BMSCs rats were isolated, cultured and passaged: bilateral femoral and tibial bone of rats were removed under sterile conditions, and flushed out bone marrow in super clean workbench, medium inoculation with 10% fetal bovine serum in the medium was changed regularly, observe the cell morphology and growth under inverted microscope, and the rat model of acute liver failure.2. identification of the cultured cells to establish and verify the weight is about 180g- 200g鍋ュ悍綰D闆勬，

本文編號：1707386