本文選題：小膠質(zhì)細(xì)胞　切入點(diǎn)：分離　出處：《鄭州大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：研究背景與現(xiàn)狀 腦血管疾病(cerebrovascular disease, CVD)作為神經(jīng)系統(tǒng)較為常見(jiàn)的疾病,是主要的公共健康問(wèn)題之一。腦梗死又稱(chēng)缺血性卒中,是指各種原因所致腦部血液供應(yīng)障礙,導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧性死亡,并出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)功能缺損的疾病。腦梗死是腦血管病的常見(jiàn)類(lèi)型,約占全部腦血管病的80%,是繼心臟病后又一種高致死性的疾病。既使有些病人幸存下來(lái)也遺留了嚴(yán)重的后遺癥,給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān),而隨著老齡化社會(huì)的到來(lái),缺血性腦病的發(fā)病率也在逐年增加,因此,尋找一種安全而有效的治療方法成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)內(nèi)容。關(guān)于腦梗死的病理變化,目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為腦部的急性缺血缺氧所導(dǎo)致的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,炎癥因子、興奮性氨基酸的釋放,氧自由基的產(chǎn)生等這些因素是造成腦損傷的重要原因,但具體的作用機(jī)制仍不清楚。小膠質(zhì)細(xì)胞(Microglia, MG)是腦內(nèi)主要的免疫細(xì)胞,具有營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)和修復(fù)神經(jīng)元的作用。靜止的MG發(fā)揮了免疫監(jiān)視作用,而活化的MG在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用仍存在較大的爭(zhēng)議。以前大量的體外研究顯示MG在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著神經(jīng)損害的作用,而近些年來(lái)的體內(nèi)研究卻顯示活化的MG不僅分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,還抑制了神經(jīng)元的凋亡,因而具有神經(jīng)保護(hù)作用。因此,明確小膠質(zhì)細(xì)胞在腦梗死中的作用將有助于解釋該病的病理過(guò)程并且有助于尋找新的治療方法,所以有必要對(duì)MG功能進(jìn)行深入研究,以期明確活化MG在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的確切作用及機(jī)制。 細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERK)分為ERK1和ERK2,統(tǒng)稱(chēng)為ERK1/2。ERK是一絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族中的一個(gè)重要成員,廣泛地參與了從細(xì)胞的代謝、活力及炎癥反應(yīng)到細(xì)胞死亡與生存的調(diào)節(jié)。腦梗死后的生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子的刺激可以經(jīng)細(xì)胞表面的三級(jí)MAPK的模式將其磷酸化而激活,活化后的ERKl/2大部分轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),促進(jìn)某些基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá),與細(xì)胞的增殖與分化密切相關(guān)。許多研究揭示磷酸化的ERK1/2主要表達(dá)于腦梗死后梗死皮層周?chē)纳窠?jīng)元內(nèi),也有文獻(xiàn)報(bào)道腦缺血的刺激可引起MG內(nèi)的ERK1/2磷酸化,活化后的ERK1/2促進(jìn)了MG合成和分泌BDNF。 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的成員之一,除分布于中樞神經(jīng)和感覺(jué)神經(jīng)以外,還分布于脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元等。由于人們認(rèn)識(shí)到BDNF在神經(jīng)疾病中的重要作用,所以對(duì)其的功能進(jìn)行了廣泛的研究,許多研究結(jié)果提示BDNF不僅對(duì)神經(jīng)元的生存、增殖、生長(zhǎng)與分化以及維持正常的神經(jīng)元功能起著重要的作用,而且還增加了神經(jīng)元對(duì)傷害性刺激的耐受性,促進(jìn)神經(jīng)元再生等作用,但目前更多學(xué)者公認(rèn)的BDNF神經(jīng)保護(hù)機(jī)制是關(guān)于BDNF在拮抗興奮性氨基酸毒性,穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度中的作用。研究表明BDNF可抑制Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放,BDNF可增加在海馬內(nèi)的含鈣結(jié)合蛋白的神經(jīng)元數(shù)量,而含鈣結(jié)合蛋白的神經(jīng)元較不含鈣結(jié)合蛋白的神經(jīng)元具有更好的抵抗谷氨酸毒性和抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高的能力,因此BDNF可通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)鈣結(jié)合蛋白來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度。 Calbindin-D28k是鈣結(jié)合蛋白的重要成員,其在腦血管疾病中的作用日益受到人們的重視,許多研究發(fā)現(xiàn)Calbindin-D28k存在于神經(jīng)元中,卻沒(méi)有參與神經(jīng)系統(tǒng)的信號(hào)傳遞,提示該蛋白通過(guò)對(duì)細(xì)胞外鈣離子濃度的調(diào)節(jié)參與了神經(jīng)元的某些生理功能,可能在突觸的聯(lián)系中發(fā)揮了一定的作用,使神經(jīng)元免于遭受由電壓差所引起的細(xì)胞內(nèi)鈣超載；Calbindin-D28k可與鈣離子高親和力地結(jié)合從而緩沖了鈣離子在細(xì)胞內(nèi)快速地增加,并參與了鈣離子的運(yùn)輸,阻止鈣離子過(guò)度地蓄積,從而保持了鈣離子濃度的相對(duì)穩(wěn)定。這些結(jié)果均提示Calbindin-D28k在腦損傷后通過(guò)抑制鈣離子的濃度過(guò)高而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。另外,進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)Calbindin-D28k能激活Ca2+/Mg2+-ATP酶活性,阻止腦內(nèi)Ca2十過(guò)度蓄積。Calbindin-D28k緩沖神經(jīng)元內(nèi)過(guò)高的鈣離子濃度和運(yùn)輸細(xì)胞內(nèi)異常升高的Ca2+是維持鈣離子穩(wěn)態(tài)不可缺少的重要因素。還有很多文獻(xiàn)報(bào)道鈣結(jié)合蛋白通過(guò)它的緩沖鈣的作用,能夠顯著地減輕缺血缺氧引起的神經(jīng)細(xì)胞的損傷。另外,Calbindin-D28k另一個(gè)神經(jīng)保護(hù)機(jī)制可能與與抑制鈣蛋白酶活性有關(guān),因?yàn)樵诩毙阅X梗死后,大量的鈣離子開(kāi)始進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞內(nèi),從而激活了鈣蛋白酶�；罨拟}蛋白酶可將神經(jīng)元內(nèi)的膜收縮蛋白(a-spectrin,神經(jīng)元的基本結(jié)構(gòu)單位)水解為分子量為145和150KDa的蛋白質(zhì)片段,從而造成神經(jīng)元的壞死。 既然MG在缺血性腦病中發(fā)揮了重要作用,而其在腦梗死特別是急性腦梗死中的作用及其作用機(jī)制仍不清楚,因此有必要在體內(nèi)進(jìn)一步研究MG的作用及作用的分子機(jī)制,以期為腦梗死的治療提供新的治療途徑與靶點(diǎn)。 目的：為體內(nèi)研究活化小膠質(zhì)細(xì)胞在急性腦梗死中的作用提供純化的種子細(xì)胞。 方法：取胎齡14天的昆明小鼠大腦,采用改良的胰蛋白酶預(yù)消化加輕拍打法提取和純化小膠質(zhì)細(xì)胞,然后采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)表面的抗原標(biāo)記,采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的純度。將經(jīng)過(guò)純化的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 結(jié)果：原代培養(yǎng)的結(jié)果顯示經(jīng)改良后的McCarthy法即胰蛋白酶預(yù)消化加輕拍打法所純化的細(xì)胞數(shù)量較多,且細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)顯示多為CD68和CDllb陽(yáng)性細(xì)胞,流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)顯示改良后的胰蛋白酶預(yù)消化加輕拍打法所收集到的CDllb陽(yáng)性細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的百分比超過(guò)了92%,而傳統(tǒng)的McCarthy方法收集的CDl1b陽(yáng)性細(xì)胞純度只有80%,并且兩種純化方法所收集的CD11b陽(yáng)性細(xì)胞的純度有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),因此,經(jīng)改良的McCarthy方法分離純化的細(xì)胞達(dá)到了實(shí)驗(yàn)要求,可以作為種子細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。 結(jié)論：胰蛋白酶預(yù)消化加輕拍打法可以分離純化到純度較高、數(shù)量較多的小膠質(zhì)細(xì)胞。 目的：體內(nèi)研究活化小膠質(zhì)細(xì)胞在大體水平對(duì)腦梗死急性期小鼠的神經(jīng)功能和梗死體積的影響。 方法：采用羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFDA-SE)液對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記,并于標(biāo)記后12、24和72h及7d在熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào),隨后用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測(cè)CFDA-SE對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖的影響。采用線栓栓塞大腦中動(dòng)脈(MCAO)方法制做腦梗死動(dòng)物模型；在觀察熒光信號(hào)達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求的72h后,將CFDA-SE標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)鎖骨下靜脈注入到MCAO小鼠體內(nèi),并分別于移植后的12、24和72h取小鼠大腦做冰凍切片以觀察小膠質(zhì)細(xì)胞在腦內(nèi)的分布與數(shù)量。完成上述的細(xì)胞標(biāo)記與示蹤實(shí)驗(yàn)后,將66只清結(jié)級(jí)昆明小鼠隨機(jī)分為四組：A組(MCAO+小膠質(zhì)細(xì)胞移植,小膠質(zhì)細(xì)胞移植組),B組(MCAO+MG培養(yǎng)基,安慰劑組),C組(MCAO組,空白對(duì)照組),D組(假手術(shù)+小膠質(zhì)細(xì)胞移植,假手術(shù)組),其中A組MCAO小鼠在術(shù)后12h接受50ì1小膠質(zhì)細(xì)胞懸液(1×105/μ1)；B組MCAO小鼠在術(shù)后12h接受與A組相同體積的培養(yǎng)基；C組小鼠在經(jīng)MCAO術(shù)未接受任何處理；D組小鼠在經(jīng)假手術(shù)12h后接受了與A組相同體積的小膠質(zhì)細(xì)胞懸液。然后分別于小膠質(zhì)細(xì)胞移植后的12、24和72h采用Zea-longa和圓筒試驗(yàn)對(duì)各組小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分,隨后處死小鼠后取腦,采用2%紅四氮唑(TTC)法測(cè)量腦梗死的體積。 結(jié)果：細(xì)胞標(biāo)記的結(jié)果顯示：于CFDA-SE標(biāo)記后的12h可在熒光顯微鏡下觀察到帶有很強(qiáng)綠色熒光信號(hào)的小膠質(zhì)細(xì)胞,并且該熒光信號(hào)一直持續(xù)到第7天,說(shuō)明該標(biāo)記液達(dá)到了本實(shí)驗(yàn)的要求,另外,MTT法檢測(cè)顯示CFDA-SE并沒(méi)有影響小膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。腦組織的冰凍切片顯示在移植后的12h,帶有熒光信號(hào)的小膠質(zhì)細(xì)胞開(kāi)始在MCAO小鼠腦內(nèi)出現(xiàn),在移植后的72h明顯增多,并且主要集中在腦梗死周?chē)�。神�?jīng)功能評(píng)定顯示與安慰劑B組和空白對(duì)照C組相比,MG移植A組小鼠Zea-longa評(píng)分降低,患側(cè)前肢首次接觸瓶壁的次數(shù)也明顯增加,并且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著的差異(p0.05)。TTC染色顯示A組小鼠的梗死體積顯著小于B和C組小鼠(p0.05)。 結(jié)論：CFDA-SE標(biāo)記液能夠?qū)π∧z質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行綠色熒光標(biāo)記,并且標(biāo)記的熒光信號(hào)能夠維持到標(biāo)記后的第7天而沒(méi)有影響小膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖；體外移植的帶有綠色熒光信號(hào)的小膠質(zhì)細(xì)胞能夠通過(guò)血腦屏障到達(dá)MCAO小鼠腦內(nèi),并且在移植后72h在腦梗死周?chē)黠@增多；體外移植的活化小膠質(zhì)細(xì)胞改善了MCAO小鼠前肢的神經(jīng)功能,減小了梗死體積。 目的：在組織及分子水平研究小膠質(zhì)細(xì)胞是否影響了腦梗死急性期神經(jīng)元的死亡和相關(guān)細(xì)胞因子的釋放。 方法：25-35g清潔級(jí)雄性昆明小鼠264只。動(dòng)物的分組及處理同第二章的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。分別于小膠質(zhì)細(xì)胞移植后的12h、24h和72h采用過(guò)量麻醉方法處死小鼠并取腦,然后采用HE染色法檢測(cè)壞死的神經(jīng)細(xì)胞,采用TUNEL染色法檢測(cè)凋亡的神經(jīng)細(xì)胞,采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)、腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等細(xì)胞因子及微管相關(guān)蛋白(MAP2)的表達(dá),采用免疫熒光雙染法檢測(cè)了磷酸化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(p-ERK1/2)在神經(jīng)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),另外,采用western blot方法檢測(cè)了神經(jīng)細(xì)胞的裂解的膜收縮蛋白(cleaved α-spectrin,神經(jīng)元的骨架結(jié)構(gòu))的表達(dá)。 結(jié)果：在小膠質(zhì)細(xì)胞移植后的24和72h與B和C組小鼠相比,A組小鼠的HE陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少,而TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞、GDNF、TNF-α和IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞卻無(wú)顯著的增加或減少,BDNF和MAP2的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著地增加,另外,cleaved α-spectrin(分子量為145KDa)的表達(dá)水平也明顯升高。免疫熒光雙染顯示p-ERK1/2除少量表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞外,還大量地表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞核。 結(jié)論：活化小膠質(zhì)細(xì)胞抑制了神經(jīng)細(xì)胞的壞死并有助于神經(jīng)細(xì)胞的存活,促進(jìn)了BDNF及p-ERK1/2的表達(dá),但并沒(méi)有影響神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)亡和TNF-a、IL-1β和GDNF的表達(dá)。 目的：研究活化小膠質(zhì)細(xì)胞在腦梗死急性期對(duì)P-ERK1/2表達(dá)的影響及其影響的意義,為活化小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制提供了理論依據(jù)。 方法：198只清潔級(jí)昆明小鼠被隨機(jī)分為四組：A組(MCAO+小膠質(zhì)細(xì)胞移植,小膠質(zhì)細(xì)胞移植組),B組(MCAO+小膠質(zhì)細(xì)胞移植+U0126,U0126抑制劑組),C組(MCAO,對(duì)照組),D組(假手術(shù)組),其中A和B組MCAO小鼠在術(shù)后12小時(shí)接受50μl小膠質(zhì)細(xì)胞懸液(1×105細(xì)胞/μ1)的移植；B組小鼠在術(shù)后接受一定劑量的U0126溶液；C組小鼠在手術(shù)后未接受任何處理。在建立腦梗死或者假手術(shù)模型后,立即將U0126溶液按照30mg/kg的劑量經(jīng)腹腔注入B組小鼠,以后每6小時(shí)注射1次直到實(shí)驗(yàn)完成,以維持一定的血藥濃度。分別于小膠質(zhì)細(xì)胞移植后的12、24和72h取腦,采用免疫組化方法檢測(cè)BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量,采用RT-PCR方法在基因水平檢測(cè)BDNF及鈣結(jié)合蛋白酶D28K(Calbindin-D28K)在各組的表達(dá),采用western-blot方法檢測(cè)了P-ERK1/2、ERK1/2、BDNF、Calbindin-D28k和cleaved-a-spectrin的表達(dá)。 結(jié)果：與B和C組小鼠相比,A組小鼠腦內(nèi)的p-ERK1/2的蛋白表達(dá)水平和BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在移植后24和72h顯著增加(P0.05)。Rt-PCR和western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示A組小鼠腦內(nèi)BDNF的表達(dá)水平在移植后24和72h顯著高于B和C組小鼠(P0.05),但A組Calbindi-D28k表達(dá)的時(shí)間較晚,在移植后72h才與B和C組有顯著差異(P0.05)。另外,在移植后的72h,A組小鼠腦內(nèi)a-spectrin(分子量為145KDa)裂解片段的蛋白表達(dá)水平顯著低于B和C組(P0.05),而B(niǎo)和C組小鼠腦內(nèi)a-spectrin(分子量為145KDa)裂解片段的蛋白表達(dá)水平卻無(wú)顯著差異(P0.05)。 結(jié)論：活化小膠質(zhì)細(xì)胞在腦梗死急性期通過(guò)p-ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)了神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的BDNF的表達(dá),進(jìn)而B(niǎo)DNF促進(jìn)了Calbindin-D28k蛋白的表達(dá),最終抑制了神經(jīng)細(xì)胞的壞死。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R743.33

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 楊忠,何家全,蔡文琴;一種改良的小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法及初步研究[J];創(chuàng)傷外科雜志;2001年03期

2 楊直堂;王建平;劉聰;許棟乾;;不同時(shí)間點(diǎn)移植的小膠質(zhì)細(xì)胞在腦梗死病理過(guò)程中作用的研究[J];中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志;2012年10期

3 余術(shù)宜,方云祥;小膠質(zhì)細(xì)胞與腦缺血[J];神經(jīng)疾病與精神衛(wèi)生;2005年04期

4 劉斌;張仲君;姜樹(shù)富;顧兆偉;;缺血性腦卒中的預(yù)防進(jìn)展[J];解放軍保健醫(yī)學(xué)雜志;2006年04期

5 宋揚(yáng),沈洪,丁愛(ài)石,范明;納洛酮對(duì)缺氧大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用[J];中華急診醫(yī)學(xué)雜志;2004年03期

6 張敏,魏桂榮,董繼華,梅元武;3種小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法的比較[J];腦與神經(jīng)疾病雜志;2005年02期

7 李兵,章翔,蔣曉帆,王彥剛,曹衛(wèi)東;改良四血管阻塞法建立大鼠全腦缺血模型[J];中華神經(jīng)外科疾病研究雜志;2005年02期

8 代玉橋;金道忠;雷德亮;;小膠質(zhì)細(xì)胞與早老性癡呆癥腦內(nèi)炎癥[J];生命科學(xué);2007年01期

9 黃秀艷;曾耀英;張彩;朱斌;;人小膠質(zhì)細(xì)胞的分離、純化、特異分子表達(dá)與吞噬功能研究[J];中國(guó)病理生理雜志;2008年05期

10 張劍;張敏;;小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞移植對(duì)腦梗死的治療作用[J];中國(guó)病理生理雜志;2009年07期

，

本文編號(hào)：1668529