本文選題：種子細(xì)胞　切入點(diǎn)：凍存　出處：《浙江大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：背景 每年因肝臟疾病死亡的人數(shù)呈現(xiàn)持續(xù)增加趨勢(shì)。人工肝作為治療肝衰竭的有效手段成為近些年的研究熱點(diǎn),其目標(biāo)為幫助病患等待適宜的供體器官或自體肝再生。我國(guó)在非生物型人工肝支持系統(tǒng)領(lǐng)域已經(jīng)取得較大進(jìn)步,但生物型人工肝系統(tǒng)的研究與國(guó)外發(fā)達(dá)國(guó)家相比尚有差距。 目的 本課題組擬選擇功能最佳的人源性永生化肝細(xì)胞制作微囊,以大規(guī)模于液氮中凍存后,在新型生物人工肝支持系統(tǒng)中檢測(cè)肝衰竭病人血漿對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用以及肝細(xì)胞對(duì)肝衰竭病人血漿的清除效果,為生物型人工肝的臨床試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 方法 1.永生化人源肝細(xì)胞的功能評(píng)價(jià)。利用MTT、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫熒光和Western blot及ELISA等檢測(cè)增殖及功能。 2.將反應(yīng)器流化培養(yǎng)的永生化肝細(xì)胞系微囊與靜態(tài)培養(yǎng)肝細(xì)胞系微囊、二維培養(yǎng)肝細(xì)胞作對(duì)比,比較細(xì)胞中與功能相關(guān)Ⅰ相酶、Ⅱ相酶和特異性核受體基因、CYP450蛋白表達(dá)的變化。檢測(cè)肝細(xì)胞生存率及白蛋白分泌和尿素合成確定凍存條件、凍存時(shí)間以及復(fù)蘇孵育條件并且評(píng)價(jià)微囊化肝細(xì)胞大規(guī)模凍存效果。 3.體外初步評(píng)價(jià)生物人工肝的有效性。收集肝衰竭病人血漿,將復(fù)蘇并孵育后的肝細(xì)胞微囊加入到肝衰竭病人血漿中培養(yǎng)24h,觀察肝衰竭病人血漿對(duì)微囊內(nèi)肝細(xì)胞活性和功能的影響以及肝衰竭病人血漿內(nèi)重要物質(zhì)成分的變化。 結(jié)果 1HepLi3細(xì)胞增殖能力最好,可以進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng),獲得高數(shù)量的細(xì)胞,而且其在功能上明顯優(yōu)于其他永生化肝細(xì)胞。 2.微囊化和流化培養(yǎng)的肝細(xì)胞在培養(yǎng)過程中保持很好的活性；微囊化的培養(yǎng)方式可以促進(jìn)肝細(xì)胞特異基因及蛋白的表達(dá)；此種培養(yǎng)方式可能是通過抑制細(xì)胞內(nèi)磷酸激酶活性來(lái)提高肝細(xì)胞特異性功能的。 3.確定微囊制作完成孵育2h后進(jìn)行凍存操作；凍存復(fù)蘇后孵育2h,其功能可恢復(fù)很好,且將體積擴(kuò)大到50毫升不會(huì)影響肝細(xì)胞的凍存后的功能。 4.肝衰竭病人血漿造成肝細(xì)胞活率下降12%,但不影響其作為種子細(xì)胞的應(yīng)用。而且微囊化肝細(xì)胞系可以改變肝衰竭病人血漿中物質(zhì)成分,促進(jìn)其體內(nèi)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 結(jié)論 1.本實(shí)驗(yàn)室制作的HepLi3可作為生物人工肝的種子細(xì)胞有效發(fā)揮肝特異性功能。 2.確定了微囊的制作,肝細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的條件,并探究蛋白激酶的抑制可能是微囊化促進(jìn)肝細(xì)胞功能的原因。 3.大規(guī)模凍存微囊化肝細(xì)胞后,細(xì)胞活性保持良好,可以為生物人工肝提供種子細(xì)胞庫(kù)。 4.利用肝衰竭病人血漿及生物反應(yīng)器證明凍存后的微囊化肝細(xì)胞可降低重肝血漿中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和直接膽紅素。
[Abstract]:Background. The number of deaths due to liver diseases is increasing every year. Artificial liver, as an effective method to treat liver failure, has become a hot research topic in recent years. Our country has made great progress in the field of non-biological artificial liver support system, but the research of biological artificial liver system is still far from that of developed countries. Purpose. Our team intends to select the best functional human immortalized hepatocytes to make microcapsules for large-scale cryopreservation in liquid nitrogen. The toxicity of plasma to hepatocytes in patients with liver failure and the clearance effect of hepatocytes to plasma of patients with liver failure were detected in a new bioartificial liver support system, which laid a foundation for clinical trials of bioartificial liver. Method. 1. Function evaluation of immortalized human hepatocytes. Proliferation and function were detected by MTT, real-time quantitative PCR, immunofluorescence, Western blot and ELISA. 2. Immortalized liver cell line microcapsules were cultured in fluidized reactor and cultured in static state. The two dimensional culture of liver cells was compared to compare the phase I enzymes related to function in the cells. The changes of CYP450 protein expression in phase 鈪，

本文編號(hào)：1667467