本文選題：骨髓間充質(zhì)干細胞　切入點：急性肝衰竭　出處：《新疆醫(yī)科大學》2013年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：(1)對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)進行體外培養(yǎng)、鑒定。(2)對D-氨基半乳糖聯(lián)合脂多糖誘導的急性肝衰竭(ALF)大鼠給予尾靜脈、門靜脈二種途徑注射同種異體移植大鼠BMSCs,探討B(tài)MSCs移植治療ALF的可能性、對比兩種移植途徑的療效。(3)通過測定各組血清及肝組織中細胞因子的表達,探討B(tài)MSCs移植治療ALF的機制、了解BMSCs在肝內(nèi)歸巢的影響因素、探討B(tài)MSCs移植對ALF血清和肝組織中細胞因子表達及肝細胞凋亡的影響及機制,為臨床開展BMSCs移植治療ALF、為臨床提供可靠的ALF預后評估系統(tǒng)、實時準確地評價ALF的免疫狀態(tài)、病情及預后并指導臨床治療提供依據(jù)。方法：(1)采用全骨髓貼壁法分離大鼠BMSCs,進行體外培養(yǎng)。采用DAPI標記BMSCs、細胞免疫熒光、流式細胞術進行BMSCs表型鑒定。(2)采用10%D-氨基半乳糖1-4g/kg/次、12小時一次和0.005%脂多糖20μg/kg,經(jīng)腹腔注射制備大鼠ALF模型,觀察造模后大鼠肝功能、肝組織病理損害程度。(3)通過尾靜脈和門靜脈注射的方式移植BMSCS。66只大鼠隨機平均分為對照組、尾靜脈移植、門靜脈組。各途徑組同種異體移植BMSCs,移植BMSCs數(shù)量為1.4×107個/kg,對照組給予等體積生理鹽水腹腔注射。于移植后24h、72h、120h、168h收集血液樣本和肝組織標本。檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST),比較BMSCs移植前后各組肝功能的改善情況。(4)用HE染色觀察肝臟的病理學變化。用TUNEL法檢測肝細胞凋亡。采用ELISA、RT-PCR方法測定各組血清及肝組織內(nèi)CD163、IL-10的水平。用原位雜交、Western blot方法檢測肝組織基質(zhì)細胞衍化生長因子-1α (SDF-1α)蛋白的表達水平；用免疫熒光組織化學法、RT-PCR方法檢測肝組織血管內(nèi)皮生長因子VEGF蛋白的表達；采用免疫組化、Western blot方法檢測肝組織Caspase-1、IL-18蛋白的表達水平。結果：(1)原代培養(yǎng)的大鼠BMSCs傳代后,高表達CD29和CD90,不表達CDllb和CD45。用DAPI進行BMSCs標記,熒光顯微鏡下觀察可見所有BMSCs均已標上藍色熒光。(2)采用了D-氨基半乳糖模型(D-Gal)/脂多糖(LPS)誘導的大鼠ALF模型。模型建立后,組織HE染色出現(xiàn)典型急性肝損傷表現(xiàn),肝衰竭對照組大鼠血清ALT. AST水平和肝細胞凋亡較BMSCs移植組明顯升高,且有時間依賴性,這些結果支持了建模成功。(3)ALF對照組大鼠血清ALT、AST水平隨病程逐漸升高,在移植后120h、168h,尾靜脈、門靜脈組移植組血清ALT、AST水平與對照組的差別均有統(tǒng)計學意義(P0.01),尾靜脈與門靜脈移植組之間血清ALT, AST水平的差別無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(4)BMSCs移植后168h,尾靜脈與門靜脈移植組大鼠肝組織均可見大量DAPI陽性標記的細胞,ALF模型對照組未見DAPIP日性標記的細胞。(5) BMSCs移植后120h、168h,尾靜脈移植組、門靜脈移植組的炎性細胞浸潤明顯減少,肝小葉結構逐漸恢復,匯管區(qū)可見膽管增生。尾靜脈組移植組、門靜脈移植組肝組織炎癥改善情況與對照組相比有統(tǒng)計學意義(P0.05)。尾靜脈組移植組、門靜脈移植組肝組織炎癥改善情況的差別無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(6)在移植后120h、168h,與對照組相比BMSCs移植組肝細胞凋亡明顯減輕(P0.05)。BMSCs移植后120h尾靜脈組、門靜脈組細胞凋亡指數(shù)分別為22.00±16.84%、20.60±7.60%；移植后168h細胞凋亡指數(shù)分別為18.33±8.78%、12.67±8.78%,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。尾靜脈和門靜脈植組之間肝細胞凋亡改善情況無統(tǒng)計學差異(P0.05)。(7)原位雜交、免疫熒光、Western blot結果顯示：BMSCs移植組中SDF-1α、VEGF蛋白的表達水平隨肝功能的好轉(zhuǎn)逐漸逐漸升高,在移植后120h、168h與對照組相比有顯著性差異(P0.05)。尾靜脈和門靜脈植組之間肝組織SDF-1α、VEGF蛋白的表達水平無統(tǒng)計學差異(P0.05)。相關分析發(fā)現(xiàn)肝組織中SDF-1α、VEGF兩者表達水平呈正相關(P0.05)。肝組織中SDF-1α、 VEGF蛋白的表達與肝細胞凋亡之間存在負相關,相關系數(shù)分別0.293、-0.274(P0.05)。(8) ELISA及RT-PCR結果顯示：ALF對照組大鼠血清及肝組織中CD163、IL-10的水平隨時間的延長、肝功能的惡化而升高。BMSCs移植組血清及肝組織中CD163、IL-10的水平隨肝功能的好轉(zhuǎn)逐漸降低,在移植后120h、168h與實驗組相比有顯著差異(P0.01)。門靜脈與尾靜脈移植組血清及肝組織中CD163、IL-10的水平之間的差別無統(tǒng)計學意義(P0.05)。相關分析發(fā)現(xiàn)血清及肝組織中CD163、IL-10兩者表達水平呈正相關(P0.05)。CD163IL-10與ALT、AST之間均有明顯的相關性(P0.01)。(9)大鼠肝組織中Caspase-1、IL-18蛋白及蛋白的表達趨勢一致,BMSCs移植后大鼠肝組織中Caspase-1和IL-18水平明顯下降,在移植后120h、68h、BMSCs移植組中Caspase-1、IL-18蛋白的表達水平與對照組相比有顯著差異(P0.05)。門靜脈組與尾靜脈移植組之間Caspase-1、IL-18蛋白的表達差別無統(tǒng)計學意義(P0.05)。尾靜脈和門靜脈植組之間Caspase-1、IL-18蛋白的表達無統(tǒng)計學差異(P0.05)。相關分析發(fā)現(xiàn)Caspase-1、IL-18兩者呈正相關(P0.05); Caspase-1、IL-18肝細胞凋亡之間均有明顯的相關性(P0.01)。結論：(1)采用全骨髓貼壁篩選法可以成功分離培養(yǎng)、擴增出高純度大鼠BMSCs,并保持其原有的生物學特性。DAPI可成功標記BMSCs。(2)采用10%D-Gall.4g/kg/次,間隔12小時,共兩次。聯(lián)合0.005%LPS (10mg/支)20μg/kg、腹腔注射可成功建立大鼠ALF模型。該方法可靠、可重復性強、模型形成穩(wěn)定、大鼠生存期較長,能滿足本研究的需要。(3) BMSCs尾靜脈、門靜脈移植后,BMSCs可以歸巢到ALF大鼠肝臟。(4) BMSCs移植能夠促進ALF大鼠肝功能的恢復,減輕肝臟組織炎癥壞死程度,BMSCs對ALF大鼠具有一定治療作用。(5)尾靜脈移植、門靜脈移植途徑均能有效改善ALF大鼠的肝功能、減輕肝臟病理損害程度。但二種途徑相比差異無統(tǒng)計學意義。(6) BMSCs移植可減少ALF肝臟免疫炎癥反應,抑制肝細胞凋亡。(7) BMSCs可以特異歸巢至損傷肝臟,促進VEGF的分泌、并促進肝細胞增殖及肝臟血管再生、促進肝臟組織修復。(8) CD163. IL-10水平隨肝組織炎癥程度改善而下降,反映了肝功能的急劇惡化和疾病嚴重程度。BMSCs移植能降低CD163、IL-10水平,調(diào)節(jié)促炎與抗炎因子達到新的平衡。CD163、IL-10可作為早期評估患者肝移植預后觀察的敏感血清標志蛋白的指標。(9)Caspase-1和IL-18在肝衰竭、肝細胞凋亡的發(fā)病過程中起重要作用。BMSCs移植能降低Caspase-1、IL-18水平。Caspase-1和IL-18可望成為急性肝衰竭的預測因子和未來的治療靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：新疆醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R575.3

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 陶方方;汪麗佩;張婷;;肝星狀細胞活化的炎性調(diào)控機制及中藥抗纖維化研究進展[J];浙江中醫(yī)藥大學學報;2011年04期

2 熊全;馮吉;王軍;熊吉;樊麗琳;胡輅;蘭春慧;楊敏;孫文靜;陳東風;;3種不同途徑移植骨髓間充質(zhì)干細胞治療肝硬化模型大鼠的效果比較[J];第三軍醫(yī)大學學報;2011年08期

3 孔凡東;潘明新;王海瀾;單毓強;高毅;;骨髓干細胞在大鼠移植肝中的誘導分化[J];南方醫(yī)科大學學報;2007年04期

4 王方;張靜;周新人;云升浩;王可敬;寇俊峰;蔡國芳;孫厚坦;;經(jīng)門靜脈自體骨髓干細胞移植治療失代償期肝硬化18例療效觀察[J];實用肝臟病雜志;2011年03期

5 張本斯,王凡,鄧力,羊惠君,李瑞祥;大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離純化與初步鑒定[J];中國組織化學與細胞化學雜志;2003年02期

6 ;Immunomodulatory effects of mesenchymal stem cells derived from adipose tissues in a rat orthotopic liver transplantation model[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2008年01期

7 鄒麗媛;彭朝權;;血紅蛋白清道夫受體與冠心病[J];國際內(nèi)科學雜志;2008年09期

8 劉芳;陳少紅;范新娟;唐芳;趙國強;;急性肝衰竭模型構建及細胞移植途徑初探[J];南華大學學報(醫(yī)學版);2006年04期

9 崔紅強;吳紹華;;骨髓間充質(zhì)干細胞研究進展[J];西南軍醫(yī);2009年04期

10 丁鵬;馮忠堂;楊智勇;余化霖;王廷華;薛黎萍;;趨化因子MCP-1體外趨化骨髓基質(zhì)細胞遷移的實驗研究[J];昆明醫(yī)學院學報;2007年03期

，

本文編號：1652813